Войти
Центральная догма, изображающая транскрипцию с кода ДНК на РНК код для белков на втором этапе, охватывающем производство белка. Производство белка - это биотехнологический процесс генерации определенного белка. Обычно это достигается манипулированием экспрессией гена в организме таким образом, чтобы он экспрессировал большие количества рекомбинантного гена. Сюда входит транскрипция рекомбинантной ДНК в мессенджер РНК (мРНК ), трансляцию мРНК в полипептидные цепи, которые в конечном итоге свернуты в функциональные белки и могут быть нацелены на конкретные субклеточные или внеклеточные участки.
Системы продуцирования белков (в лабораторный жаргон, также называемый «экспрессионными системами») используются в науках о жизни, биотехнологии и медицине. В исследованиях молекулярной биологии используются многочисленные белки и ферменты, многие из которых происходят из систем экспрессии; в частности ДНК-полимераза для ПЦР, обратная транскриптаза для анализа РНК, эндонуклеазы рестрикции для клонирования, а также для получения белков, которые подвергаются скринингу в открытие лекарств в качестве биологических мишеней или самих потенциальных лекарств. Существуют также важные применения систем экспрессии в промышленной ферментации, особенно в производстве биофармацевтических препаратов, таких как человеческий инсулин, для лечения диабета и для производства ферментов.
Обычно используемые системы производства белка включают те, которые получены из бактерий, дрожжей, бакуловирусов / насекомых, клетки млекопитающих, а в последнее время - мицелиальные грибы, такие как s Myceliophthora thermophila. Когда биофармацевтические препараты производятся с использованием одной из этих систем, связанные с процессом примеси, называемые белками клетки-хозяина, также поступают в конечный продукт в следовых количествах.
Самые старые и наиболее широко используемые системы экспрессии основаны на клетках и могут быть определены как «комбинация вектора экспрессии, его клонированной ДНК и хозяина для вектора, которые обеспечивают контекст, позволяющий функционировать чужеродному гену. в клетке-хозяине, то есть вырабатывают белки на высоком уровне ». Сверхэкспрессия - это аномально и чрезмерно высокий уровень экспрессии гена , который вызывает выраженный связанный с геном фенотип.
Существует много способов введения чужеродной ДНК в клетку для экспрессии, и для экспрессии можно использовать множество различных клеток-хозяев - каждая система экспрессии имеет свои преимущества и недостатки. На системы экспрессии обычно ссылаются хозяин и источник ДНК или механизм доставки генетического материала. Например, обычными хозяевами являются бактерии (такие как E.coli, B. subtilis ), дрожжи (такие как S.cerevisiae ) или эукариотические клеточные линии. Обычными источниками ДНК и механизмами доставки являются вирусы (такие как бакуловирус, ретровирус, аденовирус ), плазмиды, искусственные хромосомы и бактериофаг (например, лямбда ). Наилучшая система экспрессии зависит от задействованного гена , например, Saccharomyces cerevisiae часто является предпочтительным для белков, требующих значительной посттрансляционной модификации. Клеточные линии насекомых или млекопитающих используются, когда требуется сплайсинг мРНК, подобный человеку. Тем не менее бактериальная экспрессия имеет то преимущество, что легко продуцирует большие количества белка, что требуется для рентгеновской кристаллографии или ядерного магнитного резонанса для определения структуры.
Поскольку бактерии являются прокариотами, они не оснащены полным ферментативным оборудованием для выполнения необходимых посттрансляционных модификаций или молекулярного фолдинга. Следовательно, мультидоменные эукариотические белки, экспрессируемые в бактериях, часто нефункциональны. Кроме того, многие белки становятся нерастворимыми в виде телец включения, которые трудно восстановить без резких денатурирующих агентов и последующего обременительного рефолдинга белка.
Для решения этих проблем были разработаны системы экспрессии, использующие несколько эукариотических клеток для приложений, требующих, чтобы белки соответствовали или были близки к эукариотическим организмам: клеткам растений (например, табака), насекомых или млекопитающих (например, крупного рогатого скота).) трансфицируются генами и культивируются в суспензии и даже в виде тканей или целых организмов для получения полностью свернутых белков. Однако экспрессионные системы in vivo млекопитающих имеют низкий выход и другие ограничения (трудоемкость, токсичность для клеток-хозяев и т. Д.). Чтобы объединить высокую урожайность / продуктивность и масштабируемые белковые характеристики бактерий и дрожжей, а также продвинутые эпигенетические особенности систем растений, насекомых и млекопитающих, были разработаны другие системы производства белка с использованием одноклеточных эукариот (т.е. непатогенных 'Leishmania 'клетки).
E. coli, одного из самых популярных хозяев для искусственной экспрессии генов. E. coli является одним из наиболее широко используемых хозяев экспрессии, и ДНК обычно вводят в вектор экспрессии плазмиды . Методы сверхэкспрессии в E. coli хорошо разработаны и работают за счет увеличения числа копий гена или увеличения силы связывания промоторной области, что способствует транскрипции.
Например, последовательность ДНК для интересующего белка может быть клонирована или субклонирована в плазмиду с высоким числом копий, содержащую lac (часто LacUV5 ), который затем трансформируют в бактерию E. coli. Добавление IPTG (аналог лактозы ) активирует промотор lac и заставляет бактерии экспрессировать интересующий белок.
Э. coli BL21 и BL21 (DE3) - два штамма, обычно используемые для производства белка. Как представители линии B, они лишены протеаз lon и OmpT, защищающих продуцируемые белки от деградации. Профаг DE3, обнаруженный в BL21 (DE3), обеспечивает РНК-полимеразу T7 (управляемую промотором LacUV5), что позволяет использовать вместо этого векторы с промотором T7.
Непатогенные виды грамположительной Corynebacterium используются для коммерческого производства различных аминокислот. C. glutamicum широко используется для производства глутамата и лизина, компонентов пищевых продуктов для человека, кормов для животных и фармацевтических продуктов.
Экспрессия функционально активного человеческого эпидермального фактора роста была проведена в C. glutamicum, что демонстрирует потенциал промышленного производства белков человека. Экспрессированные белки могут быть нацелены на секрецию либо через общий, секреторный путь (Sec), либо через путь транслокации двойного аргинина (Tat).
В отличие от грамотрицательные бактерии, грамположительные Corynebacterium не имеют липополисахаридов, которые действуют как антигенные эндотоксины у человека.
Непатогенные и грамотрицательные бактерии, Pseudomonas fluorescens, используются для получения рекомбинантных белков на высоком уровне; обычно для разработки биотерапевтических препаратов и вакцин. P. fluorescens - это метаболически разносторонний организм, позволяющий проводить высокопроизводительный скрининг и быстрое развитие сложных белков. P. fluorescens наиболее известен своей способностью быстро и успешно продуцировать высокие титры активного растворимого белка.
Системы экспрессии с использованием S. cerevisiae или Pichia pastoris обеспечивают стабильное и продолжительное производство белков, которые обрабатываются аналогично клеткам млекопитающих с высоким выходом в белковых средах с определенным химическим составом.
Нитчатые грибы, особенно Aspergillus и Trichoderma, но также недавно Myceliophthora thermophila C1. в платформы экспрессии для скрининга и производства различных промышленных ферментов. Система экспрессии C1 показывает морфологию низкой вязкости в погруженной культуре, что позволяет использовать сложные среды для выращивания и продуцирования.
инфицированные бакуловирусом клетки насекомых (Sf9, Sf21, штаммы High Five ) или млекопитающих клетки (HeLa, HEK 293 ) позволяют продуцировать гликозилированные или мембранные белки, которые не могут быть продуцированы с использованием грибковых или бактериальных систем. Это полезно для производства белков в больших количествах. Гены не экспрессируются постоянно, потому что инфицированные клетки-хозяева в конечном итоге лизируются и умирают во время каждого цикла заражения.
Нелитическая экспрессия клеток насекомых является альтернативой литической экспрессии бакуловируса система. При нелитической экспрессии векторы временно или стабильно трансфицируют в хромосомную ДНК клеток насекомых для последующей экспрессии генов. Затем следует отбор и скрининг рекомбинантных клонов. Нелитическая система была использована для получения более высокого выхода белка и более быстрой экспрессии рекомбинантных генов по сравнению с экспрессией инфицированных бакуловирусом клеток. Клеточные линии, используемые для этой системы, включают: Sf9, Sf21 из клеток Spodoptera frugiperda, Hi-5 из Trichoplusia ni и клетки Шнайдера 2 и клетки Шнайдера 3 из клеток Drosophila melanogaster. В этой системе клетки не лизируются, и можно использовать несколько режимов культивирования. Кроме того, можно воспроизводить циклы производства белка. Эта система дает однородный продукт. Недостатком этой системы является необходимость дополнительной стадии скрининга для отбора жизнеспособных клонов.
Leishmania tarentolae (не может инфицировать млекопитающих) системы экспрессии, обеспечивающие стабильную и длительную продукцию белков с высоким выходом, в химически определенных средах. Полученные белки демонстрируют полностью эукариотические посттрансляционные модификации, включая гликозилирование и образование дисульфидной связи.
Наиболее распространенными системами экспрессии млекопитающих являются китайский хомяк клетки яичника (CHO) и эмбриональной почки человека (HEK).
Внеклеточное производство белков осуществляется in vitro с использованием очищенной РНК-полимеразы, рибосом, тРНК и рибонуклеотидов. Эти реагенты могут быть получены экстракцией из клеток или из клеточной системы экспрессии. Из-за низких уровней экспрессии и высокой стоимости бесклеточных систем более широко используются клеточные системы.
