Войти
Конструирование рекомбинантной ДНК, в которой фрагмент чужеродной ДНК вставлен в плазмидный вектор. В этом примере ген, обозначенный белым цветом, инактивируется при вставке фрагмента чужеродной ДНК. Молекулы рекомбинантной ДНК (рДНК ) представляют собой молекулы ДНК, образованные лабораторные методы генетической рекомбинации (например, молекулярное клонирование ) для объединения генетического материала из нескольких источников, создания последовательностей, которые иначе не были бы обнаружены в геном.
Рекомбинантная ДНК - это общее название фрагмента ДНК, созданного путем объединения по крайней мере двух фрагментов из двух разных источников. Рекомбинантная ДНК возможна, потому что молекулы ДНК всех организмов имеют одинаковую химическую структуру и отличаются только последовательностью нуклеотида в пределах этой идентичной общей структуры. Молекулы рекомбинантной ДНК иногда называют химерной ДНК, потому что они могут состоять из материала двух разных видов, таких как мифическая химера. Технология R-ДНК использует палиндромные последовательности и приводит к образованию липких и тупых концов.
Последовательности ДНК, используемые для создания рекомбинантных молекул ДНК, могут происходить от видов. Например, ДНК растений может быть соединена с ДНК бактерий, или ДНК человека может быть соединена с ДНК грибов. Кроме того, последовательности ДНК, которые не встречаются в природе, могут быть созданы путем химического синтеза ДНК и включены в рекомбинантные молекулы. Используя технологию рекомбинантной ДНК и синтетическую ДНК, можно создать буквально любую последовательность ДНК и ввести ее в любой из очень широкого круга живых организмов.
Белки, которые могут возникать в результате экспрессии рекомбинантной ДНК в живых клетках, называются рекомбинантными белками. Когда рекомбинантная ДНК, кодирующая белок, вводится в организм-хозяин, рекомбинантный белок не обязательно продуцируется. Экспрессия чужеродных белков требует использования специализированных векторов экспрессии и часто требует значительной реструктуризации чужеродными кодирующими последовательностями.
Рекомбинантная ДНК отличается от генетической рекомбинации тем, что первая является результатом искусственных методов в пробирке, а вторая - нормальный биологический процесс, который приводит к повторному смешиванию существующих последовательностей ДНК практически во всех организмах.
Молекулярное клонирование - это лабораторный процесс, используемый для создания рекомбинантной ДНК. Это один из двух наиболее широко используемых методов, наряду с полимеразной цепной реакцией (ПЦР), используемых для управления репликацией любой конкретной последовательности ДНК, выбранной экспериментатором. Между методами есть два принципиальных различия. Во-первых, молекулярное клонирование включает репликацию ДНК внутри живой клетки, в то время как ПЦР реплицирует ДНК в пробирке, свободной от живых клеток. Другое отличие состоит в том, что клонирование включает вырезание и вставку последовательностей ДНК, тогда как ПЦР амплифицируется путем копирования существующей последовательности.
Для образования рекомбинантной ДНК требуется вектор клонирования, молекула ДНК, которая реплицируется в живой клетке. Векторы обычно происходят из плазмид или вирусов и представляют собой относительно небольшие сегменты ДНК, которые содержат необходимые генетические сигналы для репликации, а также дополнительные элементы для удобства вставки чужеродной ДНК и идентификации клеток. которые содержат рекомбинантную ДНК и, при необходимости, экспрессируют чужеродную ДНК. Выбор вектора для молекулярного клонирования зависит от выбора организма-хозяина, размера клонируемой ДНК и от того, должна ли и как экспрессироваться чужеродная ДНК. Сегменты ДНК могут быть объединены с использованием различных методов, таких как клонирование рестрикционного фермента / лигазы или сборка Гибсона.
В стандартных протоколах клонирования клонирование любого фрагмента ДНК по существу включает семь этапов: (1) Выбор организм-хозяин и вектор клонирования, (2) Получение векторной ДНК, (3) Подготовка ДНК для клонирования, (4) Создание рекомбинантной ДНК, (5) Введение рекомбинантной ДНК в организм-хозяин, (6) Отбор организмов содержащих рекомбинантную ДНК, и (7) Скрининг клонов с желаемыми вставками ДНК и биологическими свойствами. Эти этапы подробно описаны в соответствующей статье (молекулярное клонирование ).
После трансплантации в организм-хозяин чужеродная ДНК, содержащаяся в конструкции рекомбинантной ДНК, может быть, а может и не быть экспрессирована. То есть ДНК может просто реплицироваться без экспрессии, или она может быть транскрибирована и транслирована, и получается рекомбинантный белок. Вообще говоря, экспрессия чужеродного гена требует реструктуризации гена для включения последовательностей, которые требуются для производства молекулы мРНК, которая может использоваться трансляционным аппаратом хозяина (например, промотором, сигнал инициации трансляции и терминатор транскрипции ). В организм-хозяин могут быть внесены специфические изменения для улучшения экспрессии эктопического гена. Кроме того, могут потребоваться изменения и в кодирующих последовательностях, чтобы оптимизировать трансляцию, сделать белок растворимым, направить рекомбинантный белок в нужное клеточное или внеклеточное местоположение и стабилизировать белок от разрушения.
В большинстве случаев организмы, содержащие рекомбинантную ДНК, имеют явно нормальные фенотипы. То есть их внешний вид, поведение и метаболизм обычно не изменяются, и единственный способ продемонстрировать присутствие рекомбинантных последовательностей - это исследовать саму ДНК, обычно с использованием теста полимеразной цепной реакции (ПЦР). Существуют значительные исключения, которые обсуждаются ниже.
Если последовательности рДНК кодируют ген, который экспрессируется, то присутствие РНК и / или белковых продуктов рекомбинантного гена может быть обнаружено, обычно с помощью ОТ-ПЦР или методы западной гибридизации. Грубые фенотипические изменения не являются нормой, если только рекомбинантный ген не был выбран и модифицирован так, чтобы вызвать биологическую активность в организме хозяина. Дополнительные встречающиеся фенотипы включают токсичность для организма-хозяина, индуцированную рекомбинантным генным продуктом, особенно если он сверхэкспрессируется или экспрессируется в неподходящих клетках или тканях.
В некоторых случаях рекомбинантная ДНК может оказывать вредное воздействие, даже если она не экспрессируется. Одним из механизмов, с помощью которого это происходит, является инсерционная инактивация, при которой рДНК вставляется в ген клетки-хозяина. В некоторых случаях исследователи используют это явление для «нокаута » генов, чтобы определить их биологическую функцию и важность. Другой механизм, с помощью которого вставка рДНК в хромосомную ДНК может влиять на экспрессию генов, - это неправильная активация ранее невыраженных генов клетки-хозяина. Это может произойти, например, когда фрагмент рекомбинантной ДНК, содержащий активный промотор, оказывается рядом с ранее молчащим геном клетки-хозяина, или когда ген клетки-хозяина, который функционирует, чтобы сдерживать экспрессию гена, подвергается инсерционной инактивации рекомбинантной ДНК.
Рекомбинантная ДНК широко используется в биотехнологии, медицине и исследованиях. Сегодня рекомбинантные белки и другие продукты, полученные в результате использования технологии ДНК, можно найти практически в каждой западной аптеке, у врача или ветеринара, в медицинской испытательной лаборатории и лаборатории биологических исследований. Кроме того, организмы, с которыми манипулировали с помощью технологии рекомбинантной ДНК, а также продукты, полученные из этих организмов, нашли свое применение во многих фермах, супермаркетах, шкафах домашней медицины и даже зоомагазины, например, те, которые продают GloFish и других генетически модифицированных животных.
Чаще всего рекомбинантная ДНК применяется в фундаментальных исследованиях, в которых технология важна для большинства текущих работ в области биологические и биомедицинские науки. Рекомбинантная ДНК используется для идентификации, картирования и определения последовательности генов, а также для определения их функции. Зонды рДНК используются для анализа экспрессии генов в отдельных клетках и в тканях целых организмов. Рекомбинантные белки широко используются в качестве реагентов в лабораторных экспериментах и для создания зондов антител для изучения синтеза белка в клетках и организмах.
Многие дополнительные практические применения рекомбинантной ДНК можно найти в промышленности, производстве продуктов питания, медицине и ветеринарии. сельское хозяйство и биоинженерия. Ниже приведены некоторые конкретные примеры.
Идея рекомбинантной ДНК была впервые предложена Питером Лоббаном, аспирантом проф. Дейл Кайзер на факультете биохимии Медицинской школы Стэнфордского университета. Первые публикации, описывающие успешное производство и внутриклеточную репликацию рекомбинантной ДНК, появились в 1972 и 1973 годах в Stanford и UCSF. В 1980 Пол Берг, профессор кафедры биохимии в Стэнфорде и автор одной из первых статей, был удостоен Нобелевской премии по химии за свою работу по нуклеиновым кислотам «с особым вниманием к рекомбинантной ДНК». Вернер Арбер, Гамильтон Смит и Дэниел Натанс разделили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1978 года за открытие ограничения эндонуклеазы, которые усовершенствовали методы технологии рДНК.
Стэнфордский университет подал заявку на патент США на рекомбинантную ДНК в 1974 году, указав изобретателей как Герберт Бойер (профессор Калифорнийского университета, Сан-Франциско ) и Стэнли Н. Коэн (профессор Стэнфордского университета ); этот патент был выдан в 1980 году. Первым лицензированным лекарством, созданным с использованием технологии рекомбинантной ДНК, был человеческий инсулин, разработанный Genentech и лицензированный Eli Lilly and Company.
Scientists связанные с первоначальной разработкой методов рекомбинантной ДНК, было признано, что существует потенциал для организмов, содержащих рекомбинантную ДНК, иметь нежелательные или опасные свойства. На конференции Асиломара по рекомбинантной ДНК 1975 года обсуждались эти проблемы, и был введен добровольный мораторий на исследования рекомбинантной ДНК для экспериментов, которые считались особенно рискованными. Этот мораторий широко соблюдался до тех пор, пока Национальные институты здравоохранения (США) не разработали и не выпустили официальные инструкции по работе с рДНК. Сегодня рекомбинантные молекулы ДНК и рекомбинантные белки обычно не считаются опасными. Однако остаются опасения по поводу некоторых организмов, экспрессирующих рекомбинантную ДНК, особенно когда они покидают лабораторию и попадают в окружающую среду или в пищевую цепь. Эти опасения обсуждаются в статьях о генетически модифицированных организмах и спорах о генетически модифицированных пищевых продуктах. Кроме того, существуют опасения по поводу побочных продуктов в биофармацевтическом производстве, когда рекомбинантная ДНК приводит к образованию определенных белковых продуктов. Основной побочный продукт, называемый белок клетки-хозяина, исходит из системы экспрессии хозяина и представляет угрозу для здоровья пациента и окружающей среды в целом.
Биологический портал 