Войти
| Pichia pastoris | |
|---|---|
| Научная классификация | |
| Царство: | Грибы |
| Тип: | Аскомикота |
| Класс: | Saccharomycetes |
| Порядок: | Saccharomycetales |
| Семейство: | Saccharomycetaceae |
| Род: | Pichia / Komagataella |
| Виды: | pastoris |
| Биномиальное название | |
| Pichia pastoris . | |
Клетки Pichia pastoris Pichia pastoris - это вид метилотрофных дрожжей. Он был обнаружен в 1960-х годах с его особенностью использования метанола в качестве источника углерода и энергии. После многих лет исследований P. pastoris широко использовался в биохимических исследованиях и биотехнологических отраслях. Обладая большим потенциалом быть экспрессирующей системой для продукции белка, а также быть модельным организмом для генетических исследований, P. pastoris стал важным для биологических исследований. и биотехнологические приложения. В последнее десятилетие в некоторых отчетах P. pastoris был повторно отнесен к роду Komagataella с помощью филогенетического анализа путем секвенирования генома P. pastoris. Вид был разделен на K. phaffii, К. pastoris и К. pseudopastoris .
Естественно, P. pastoris живут на деревьях, таких как каштаны. Они гетеротрофы и могут использовать несколько источников углерода для жизни, например, глюкозу, глицерин и метанол. Однако они не могут использовать лактозу.
P. pastoris может подвергаться как бесполому размножению, так и половому размножению посредством почкования и аскоспор. В этом случае существуют два типа клеток P. pastoris: гаплоидные и диплоидные клетки. В бесполом жизненном цикле гаплоидные клетки подвергаются митозу для размножения. В половом жизненном цикле диплоидные клетки подвергаются споруляции и мейозу. Скорость роста его колоний может варьироваться в широком диапазоне, от почти 0 до времени удвоения в один час, что подходит для промышленных процессов.
В последние несколько лет P. pastoris был исследован и идентифицирован как хороший модельный организм с рядом преимуществ. Прежде всего, P. patoris можно легко выращивать и использовать в лаборатории. Как и другие широко используемые модели дрожжей, он имеет относительно короткий срок службы и быстрое время регенерации. Более того, были разработаны недорогие питательные среды, на которых P. patoris может быстро расти с высокой плотностью клеток. Было выполнено полное секвенирование генома P. patoris. Геном P. pastoris GS115 был секвенирован Институтом биотехнологии Фландрии и Гентским университетом и опубликован в журнале Nature Biotechnology. Последовательность генома и аннотацию гена можно просмотреть в системе ORCAE. Полные геномные данные позволяют ученым идентифицировать гомологичные белки и эволюционные отношения между другими видами дрожжей и P. pastoris. Furthurmore, P. pastoris - это отдельные эукариотические клетки, что означает, что исследователи могут исследовать белки внутри P. pastoris. Затем можно провести гомологичное сравнение с другими более сложными видами эукариот, чтобы получить их функции и происхождение.
Еще одним преимуществом P. pastoris является его сходство с хорошо изученной моделью дрожжей - Saccharomyces cerevisiae. Как модельный организм для биологии, S. cerevisiae были хорошо изучены на протяжении десятилетий и использовались исследователями для различных целей на протяжении всей истории. Два рода дрожжей; Pichia и Saccharomyces имеют сходные условия роста и допуски; таким образом, культура P. pastoris может быть принята лабораториями без каких-либо изменений. Более того, в отличие от S. cerevisiae, P. pastoris обладает способностью функционально обрабатывать белки с большой молекулярной массой, что полезно для трансляционного хозяина. Учитывая все преимущества, P. pastoris можно успешно использовать как в качестве генетической, так и в качестве экспериментальной модели организма.
Как генетический модельный организм P. pastoris может использоваться для генетического анализа и крупномасштабного генетического скрещивания с полными данными генома и его способностью выполнять сложный генетический процессинг эукариот в относительно небольшом геноме. Функциональные гены сборки пероксисомы были исследованы путем сравнения штаммов дикого типа и мутантных штаммов P. pastoris.
Как экспериментальный модельный организм, P. pastoris в основном использовался как система хозяина для трансформации. Из-за его способности рекомбинации с чужеродной ДНК и обработки больших белков было проведено много исследований для изучения возможности производства новых белков и функции искусственно созданных белков с использованием P. pastoris в качестве хозяина трансформации. В последнее десятилетие P. pastoris был сконструирован для создания платформ системы экспрессии, которые являются типичным приложением для стандартной экспериментальной модели организма, как описано ниже.
P. pastoris часто используется в качестве системы экспрессии для продукции гетерологичных белков. Несколько свойств делают P. pastoris подходящим для этой задачи. В настоящее время несколько штаммов P. pastoris используются в биотехнических целях, при этом между ними наблюдаются значительные различия в росте и производстве белка. Некоторые распространенные варианты обладают мутацией в гене HIS4, что приводит к отбору клеток, которые успешно трансформированы с помощью экспрессионных векторов. Технология интеграции вектора в геном P. pastoris аналогична технологии в Saccharomyces cerevisiae.
1: P. pastoris способен расти на простой недорогой среде с высокой скоростью роста. P. pastoris может расти либо в встряхиваемых колбах, либо в ферментере, что делает его пригодным как для мелкого, так и для крупномасштабного производства.
2: P. pastoris имеет два гена алкогольоксидазы, Aox1 и Aox2, которые включают сильно индуцибельные промоторы. Эти два гена позволяют Pichia использовать метанол в качестве углерода и источника энергии. Промоторы АОХ индуцируются метанолом и подавляются глюкозой. Обычно ген желаемого белка вводится под контролем промотора Aox1, что означает, что продукцию белка можно индуцировать добавлением метанола в среду. После нескольких исследований ученые обнаружили, что промотор, полученный из гена AOX1 у P. pastoris, чрезвычайно подходит для контроля экспрессии чужеродных генов, которые были преобразованы в геном P. pastoris, производя гетерологичные белки.
3 : С ключевым признаком P. pastoris может расти с чрезвычайно высокой плотностью клеток в культуре. Эта функция совместима с экспрессией гетерологичного белка, что дает более высокий выход продукции.
4: Технология, необходимая для генетической обработки P. pastoris, аналогична технологии Saccharomyces cerevisiae, которая является одной из наиболее хорошо изученных дрожжевые модельные организмы. В результате протокол эксперимента и материалы для P. pastoris легко подобрать.
Так как некоторым белкам требуется шаперонин для правильной укладки, Pichia не может продуцируют ряд белков, поскольку P. pastoris не содержит соответствующих шаперонов. Технологии введения генов шаперонинов млекопитающих в геном дрожжей и сверхэкспрессии существующих шаперонинов все еще нуждаются в улучшении
В стандартных исследованиях молекулярной биологии бактерии Escherichia coli является наиболее часто используемым организмом в качестве системы экспрессии для производства гетерологичных белков из-за его характеристик высокой скорости роста, высокой скорости продукции белка, а также нетребовательных условий роста. Производство белка у E. coli обычно выше, чем у P. pastoris, по следующим причинам: Компетентный E. coli можно хранить в замороженном виде и размораживать перед использованием, тогда как клетки Pichia должны быть получены непосредственно перед использованием. Выходы экспрессии в Pichia варьируются в зависимости от различных клонов, поэтому необходимо провести скрининг большого количества клонов. производство протеина, чтобы найти лучшего производителя. Самым большим преимуществом Pichia перед E. coli является то, что Pichia способна образовывать дисульфидные связи и гликозилирование в белках, а E. coli - нет. E. coli может продуцировать неправильно свернутый белок, когда дисульфиды включены в конечный продукт, что приводит к неактивным или нерастворимым формам белков.
Хорошо изученный Saccharomyces cerevisiae также используется в качестве экспрессирующей системы с аналогичными преимуществами по сравнению с E. coli как Pichia. Однако у Pichia есть два основных преимущества перед S. cerevisiae в лабораторных и промышленных условиях:
По сравнению с другими системами экспрессии, таких как S2-клетки из Drosophila melanogaster и клеток яичников китайского хомячка, Pichia обычно дает гораздо более высокие урожаи. Как правило, клеточные линии из многоклеточных организмов требуют сложных и дорогих типы сред, включая аминокислоты, витамины, а также другие факторы роста. Эти типы сред значительно увеличивают стоимость производства гетерологичных белков. Кроме того, поскольку Pichia может расти в среде, содержащей только один источник углерода и один источник азота, что подходит для приложений с изотопной маркировкой, таких как ЯМР белка.
P. pastoris использовались в нескольких видах биотехнологической промышленности, таких как фармацевтическая промышленность. Все приложения основаны на его способности экспрессировать белки.
В последние несколько лет Pichia pastoris использовалась для производства более 500 типов биотерапевтических средств, таких как IFNγ. Вначале одним из недостатков этой системы экспрессии белка является чрезмерное гликозилирование с высокой плотностью структуры маннозы, что является потенциальной причиной иммуногенности. В 2006 году исследовательской группе удалось создать новый штамм под названием YSH597. Этот штамм может экспрессировать эритропоэтин в его нормальной форме гликозилирования путем обмена ферментов, ответственных за гликозилирование грибкового типа, с гомологами млекопитающих. Таким образом, измененный паттерн гликозилирования позволил белку быть полностью функциональным.
В пищевой промышленности, такой как пивоварня и пекарня, Pichia pastoris используется для производства различных видов ферменты, такие как вспомогательные вещества и пищевые добавки, с множеством функций. Например, некоторые ферменты, вырабатываемые генетически модифицированной Pichia pastoris, могут сохранять хлеб мягким. Между тем, в пиве можно использовать ферменты для снижения концентрации алкоголя.
