Войти
Геном HCV. NS5A в нижнем ряду, второй справа. Ингибиторы неструктурного белка 5A (NS5A) представляют собой противовирусные агенты прямого действия (DAA), нацеленные на вирусные белки, и их разработка стала кульминацией более глубокое понимание жизненного цикла вируса в сочетании с достижениями в технологии открытия лекарств. Однако их механизм действия сложен и до конца не изучен. Ингибиторы NS5A были в центре внимания, когда они появились как часть первого лечебного средства от инфекций, вызванных вирусом гепатита C (HCV) в 2014 году. Благоприятные характеристики были введены за счет различных структурных изменений и структурного сходства между Клинически одобренные ингибиторы NS5A очевидны. Несмотря на недавнее внедрение множества новых противовирусных препаратов, устойчивость по-прежнему вызывает беспокойство, и поэтому эти ингибиторы всегда используются в комбинации с другими лекарствами.
HCV представляет собой одноцепочечный РНК-вирус с положительным смыслом, который, как было продемонстрировано, реплицируется в гепатоцитах как человека, так и шимпанзе. Один полипротеин HCV транслируется, а затем расщепляется клеточными и вирусными протеазами на три структурных белка (сердцевинный, E1 и E2) и семь неструктурных белков ( p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B ).
HCV является одной из основных причин болезни печени во всем мире. Она передается через кровь и чаще всего передается через инфицированные иглы. Пациенты, страдающие хронической инфекцией ВГС, подвергаются значительному риску цирроза и гепатоцеллюлярная карцинома, которые являются основными причинами смерти инфицированных.
Вирус существует уже более тысячелетия и был классифицирован на шесть известных генотипов, каждый из которых содержит множество подтипов. Седьмой остается не охарактеризованным. Контрактный генотип определяет, какие конкретные методы лечения являются жизнеспособными.
NS5A i s большой гидрофильный фосфопротеин, который важен для жизненного цикла ВГС и обнаруживается в ассоциации с вирус-индуцированными мембранными везикулами, называемыми мембранной сеткой. NS5A представляет собой богатый пролином белок, состоящий приблизительно из 447 аминокислот, который разделен на три домена. Эти домены связаны двумя последовательностями низкой сложности, которые богаты либо серином-, либо пролином. Домен I представляет собой цинк-связывающий домен, и исследования рентгеновской кристаллографии показали альтернативные димерные конформации домена I NS5A. Домены II и III неструктурированы, как показывают исследования ЯМР. Домену I предшествует N-конец амфипатическая спираль, которая позволяет белку связываться с мембранами, производными эндоплазматического ретикулума. Хотя рентгеноструктурные исследования выявили димерные конформации домена 1 NS5A, недавние исследования структурных характеристик растворов показали, что белки NS5A образуют структуры более высокого порядка с помощью димерных субъединиц домена 1 NS5A. Более того, общая структурная модель NS5A подчеркивает изменчивость внутренних конформаций. доменов D2 и D3 между генотипами HCV. Таким образом, до сих пор ведутся дискуссии о том, какие конформации NS5A являются функциональными и на которые нацелены ингибиторы NS5A.
NS5A в основном существует в двух различных фосфорилированных формах, гипофосфорилированной и гиперфосфорилированной форме, но точная функция фосфорилирования не определена.
Белок NS5A играет важную роль в репликации вирусной РНК, сборке вируса и сложных взаимодействиях с клеточными функциями. Белок участвует в модуляции защитных механизмов хозяина, апоптоза, клеточного цикла и чувствительных к стрессу путей. Однако его функция и полная структура еще предстоит выяснить.
NS5A, по-видимому, играет ключевую роль в запуске образования мембранной сети в отсутствие других подобных неструктурных белков. NS5A может влиять на многие белки в клетке-хозяине, например фосфатидилинозитол-4-киназа IIIα (PI4KIIIα), киназа, необходимая для репликации HCV. Эта киназа участвует в биосинтезе фосфатидилинозитол-4-фосфата (PI4P), взаимодействуя с NS5A, что стимулирует его активность и, по-видимому, улучшает целостность мембранной сети.
В последнее время центральная роль NS5A в вирусной пролиферации сделала его мишенью для разработки лекарств. В результате были введены новые противовирусные агенты для лечения ВГС.
Ингибиторы NS5A были разработаны для нацеливания на белок NS5A. Эти ингибиторы привели к значительному снижению уровня РНК HCV в крови и поэтому могут рассматриваться как мощные противовирусные препараты. Считается, что их механизм действия разнообразен, но точный механизм до конца не изучен. Большинство исследований предполагает, что ингибиторы NS5A действуют на двух основных стадиях жизненного цикла ВГС; репликация геномной РНК и сборка вирионов. В других исследованиях предлагается изменение факторов клетки-хозяина в качестве возможного третьего механизма.
Предполагаемый механизм действия ингибитора NS5A . Ингибитор связывается с доменом 1 NS5A и предотвращает связывание РНК, тем самым нарушая репликацию РНК. Структура ингибиторов NS5A характеризуется димерной симметрией. Это говорит о том, что ингибиторы NS5A действуют на димеры NS5A. Ряд модельных исследований показал, что даклатасвир, который является ингибитором NS5A, связывается только с димером NS5A «спина к спине», и что связывание должно быть симметричным. Другие исследования моделирования показали, что возможно связывание с другими конформациями NS5A, а также асимметричное связывание. Исследования показали, что мишенью даклатасвира, скорее всего, является домен I NS5A. Несмотря на то, что механизм не полностью понят, было продемонстрировано, что ингибиторы подавляют гиперфосфорилирование NS5A, что приводит к подавлению репликации HCV и его процессинга полипротеинов, а также приводит к необычному расположению белка. До сих пор считалось, что для этого ингибирования требуется только домен I NS5A, но не домены II и III. Однако недавние исследования показали, что оба домена I и II имеют отношение к этому нарушению репликации РНК.
Ингибиторы NS5A, по-видимому, также нарушают образование новых комплексов репликазы, что приводит к постепенному замедлению синтеза вирусной РНК. Эффект на ранее образованные комплексы еще предстоит продемонстрировать.
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что ингибиторы NS5A изменяют расположение NS5A внутри клетки. Это может вызвать ненормальную сборку, что приведет к появлению уродливых вирусов. Некоторые исследования показали, что ингибирование сборки вируса играет более важную роль в уменьшении РНК, чем уменьшение репликации вируса.
Исследования показали, что ингибиторы NS5A блокируют образование мембранной сети, которая защищает вирус геном и содержит основные сайты репликации и сборки вирусов. Считается, что этот механизм не зависит от репликации РНК, но, по-видимому, на него влияют ингибиторы NS5A, блокирующие образование комплекса PI4KIIIα-NS5A, необходимого для синтеза PI4P, что приводит к снижению целостности мембранной сети и, следовательно, к снижению РНК HCV. репликация.
В последние годы исследования ВГС достигли больших успехов с открытием и клинической разработкой множества новых лекарств от ВГС. К таким лекарствам относятся ПППД, в состав которых входят ингибиторы NS5A. Было обнаружено, что ингибиторы NS5A особенно эффективны при лечении ВГС, когда они использовались в сочетании с другими ингибиторами протеазы, такими как ингибиторы NS5B (например, софосбувир ), пегилированные интерфероны (например, пегинтерферон альфа-2а ) и рибонуклеиновые аналоги (например, рибавирин ). Постоянно существующий риск вирусных штаммов развития устойчивости был основным фактором, почему они используются в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарствами.
Побочные эффекты и обширные и сложные схемы приема лекарств с сопутствующими низкими показателями соблюдения режима лечения были препятствием для разработки противовирусных препаратов. Комбинация ингибиторов NS5A и NS5B дала положительные результаты в этом отношении.
В настоящее время (25 июля 2016 г.) существует четыре NS5A клинически одобренных ингибиторов, и многие другие находятся в стадии разработки или клинических испытаний. Даклатасвир был первым клинически одобренным ингибитором NS5A. Структурное сходство между даклатасвиром и более новыми ингибиторами показано синим цветом. Даклатасвир был разработан Bristol-Myers Squibb, ледипасвир Gilead Sciences, омбитасвир AbbVie Inc. и элбасвир от Merck Co. Открытие ингибиторов NS5A имело место в контексте поиска средств лечения HCV. NS5A является одним из семи неструктурных белков, которые образуют комплекс с вирусной РНК в инфицированных клетках, чтобы инициировать репликацию HCV. В ходе исследований HCV было получено несколько ПППД, включая ингибиторы NS3A, NS4A и NS5B, а также ингибиторы NS5A.
Разработаны противовирусные препараты, способные вмешиваться в белки, ответственные за репликацию вирусов. тесно связано с достижениями в технологиях создания эффективных систем клеточных культур, необходимых для скрининга на их наличие.
В 1999 году произошел прорыв, когда был разработан консенсусный геном полной длины клонированный из РНК HCV, как было обнаружено, реплицируется на высоких уровнях при трансфекции в клеточную линию гепатомы человека. С тех пор этот метод был усовершенствован за счет использования адаптивных мутаций в культуре клеток, которые усиливают репликацию РНК.
В результате скрининга был получен ряд ингибиторов NS5A, которые были включены в лечение HCV. Первым в этом новом классе препаратов был даклатасвир, который получил одобрение FDA в 2015 году. С тех пор были одобрены и другие препараты, в частности, ледипасвир, которые вместе с софосбувиром составляют вирус гепатита С. лекарство Харвони.
Хотя ингибиторы NS5A доказали свою эффективность в качестве противовирусных препаратов, их следует использовать вместе с дополнительными противовирусными препаратами, поскольку они быстро приводят к развитию устойчивых мутаций при применении в качестве одного агента. Это сформировало фокус разработки ингибитора NS5A, из которого, помимо других открытий, появились асимметричные варианты, которые метаболизируют в аналоги с дополнительными профилями резистентности.>Структурное сходство между ингибиторами очевидно. Придатки центрального ядра обычно симметричны и имеют структуру имидазол -пролин. Было обнаружено, что природная L-конфигурация производных пролина имеет решающее значение для ингибирования, поскольку неестественная D-конфигурация имела значительно более слабую активность. эффективность ингибиторов была соответственно чувствительна к изменениям в блокирующем элементе амина. Эти наблюдения предполагают, что аминовая область молекул играет важную роль в ингибирующей активности.
Благоприятные характеристики ингибитора NS5A включают высокую эффективность и длительный период полувыведения из плазмы для достижения дозировки один раз в день. Было обнаружено, что слегка асимметричные придатки, наблюдаемые у ледипасвира, обладают отличительными преимуществами для оптимизации эффективности ингибитора и фармакокинетики. Структура центрального ядра изменяет расстояние и проекцию придатков, а также положение липофильности в центральном ядре, что заметно влияет на ингибирующую активность. Структуры со слитыми центральными кольцами последовательно демонстрируют большую ингибирующую активность, тогда как менее липофильные центральные ядра обеспечивают более слабую активность. Симметричные бис-имидазольные структуры, такие как даклатасвир, теряют свою эффективность, когда флуорен заменен на биарил группу. Эта замена также порождает серьезные проблемы со стабильностью. Однако липофильный соединитель меньшего размера, такой как дифторметилен, генерирует наиболее мощный ингибитор в асимметричной структуре. Кроме того, он обеспечивает улучшенную биодоступность и более благоприятный период полувыведения из плазмы. Также наблюдается заметное увеличение активности, когда фенил заменяется на нафтил в качестве центрального ядра. Это увеличение значительно выше в асимметричной структуре, чем в симметричной. В асимметричных структурах разница в эффективности между ингибиторами фенил- алкинов демонстрирует важность положения липофильности. Более центрально расположенный алкин, который является менее липофильным соединителем, чем фенил, улучшает эффективность.
| ||
|---|---|---|
| Структура | Активность | |
| X | IC50(нМ) | Ингибирующая активность |
| >44 | Нет |
| >44 | Нет |
| 11 | Очень слабое |
| 1,7 | Слабое |
| 0,50 | Умеренное |
| 3,7 | Слабое |
| 0,11 | Умеренное |
| 0,20 | Умеренное |
| ||
|---|---|---|
| Структура | Активность | |
| X | IC50(нМ) | Ингибирующая активность |
| >44 | Нет |
| 0,071 | Умеренное |
| 2,5 | Слабое |
| 0,38 | Умеренное |
| 0,20 | Умеренное |
| 0,17 | Умеренный |
| 0,040 | Сильный |
| ||
|---|---|---|
| Структура | Активность | |
| X | IC50(нМ) | Ингибирующая активность |
| CH2 | 0,094 | Сильная |
| CO | 0,30 | Умеренная |
| C (CH 3)2 | 1,2 | Слабая |
Возможная устойчивость HCV к препаратам DAA вызывает беспокойство. Среди квазивидов HCV существуют ранее существовавшие варианты, потенциально способные придать устойчивость к ингибиторам NS5A без какого-либо предшествующего воздействия этих препаратов. Как правило, воспроизведение этих вариантов происходит только в незначительных количествах, что делает их необнаружимыми с помощью современных методов. С другой стороны, можно избирательно выращивать иммунные варианты в присутствии ингибиторов NS5A. Устойчивость к ВГС характеризуется определенной закономерностью побега. Этот паттерн часто связан с аминокислотными заменами, которые придают вирусу стойкую лекарственную устойчивость без ухудшения его пригодности. Было установлено, что ингибиторы NS5A обладают относительно низким порогом устойчивости, и было показано, что варианты, которые связаны с устойчивостью к NS5A, сохраняются у пациентов до шести месяцев после прекращения лечения. Таким образом, комбинированная терапия обеспечивает более высокую эффективность и более короткие периоды лечения.
Разработчики DAA столкнутся в ближайшие годы с предсказуемыми проблемами. Необходимо будет ликвидировать терапевтические пробелы для людей, страдающих от осложнений, таких как хроническая болезнь почек и цирроз. Более короткие методы лечения с более легкими побочными эффектами позволят добиться большей приверженности, и нависает вездесущий призрак лекарственной устойчивости. Высокоадаптивный ВГС превратился в ряд различных геномов, которые все нуждаются в адекватном лечении, предпочтительно с использованием пангенотипических схем.
Некоторые из этих проблем уже имеют возможные решения. Ингибитор протеазы ABT-493 и ингибитор NS5A следующего поколения ABT-530 считаются активными против всех генотипов HCV, включая трудно поддающийся лечению генотип 3. In vitro ABT-530 показал эффективность против вариантов, связанных с устойчивостью, которые невосприимчивы к первые поколения ингибиторов NS5A, включая ледипасвир, даклатасвир и омбитасвир. Поскольку эта комбинация лекарств обладает дополнительным качеством очистки печени, она дает надежду на то, что пациенты, страдающие хроническим заболеванием почек и гепатитом С, в ближайшем будущем смогут получить безопасное лечение, не основанное на софосбувире.
По крайней мере, три комбинации препаратов для лечения ВГС находятся в стадии разработки, которые будут одобрены в 2016-2017 годах: софосбувир в сочетании с велпатасвиром, ABT-493 в сочетании с ABT-530 и гразопревир в сочетании с элбасвиром, из которых велпатасвир, ABT-530 и эльбасвир являются ингибиторами NS5A.
