Войти
Этап расщепление в геле является частью подготовки образца для масс-спектрометрической идентификации белков в ходе протеомного анализа. Метод был представлен в 1992 году Розенфельдом. Бесчисленные модификации и улучшения в основных элементах процедуры остаются.
Стадия разложения в геле в основном включает четыре стадии; обесцвечивание, восстановление и алкилирование (RA) цистеинов в белке, протеолитическое расщепление белка и экстракция образовавшихся пептиды.
Белки, которые были разделены 1D или 2D СТРАНИЦА обычно визуализируется окрашиванием красителями, такими как кумасси бриллиантовый синий (CBB) или серебром. Хотя чувствительность метода значительно ниже, использование Кумасси более распространено для образцов, предназначенных для масс-спектрометрии, поскольку окрашивание серебром ухудшает анализ. После удаления интересующей полосы белка из геля для большинства протоколов требуется удаление белков перед продолжением.
Обесцвечивающий раствор для CBB обычно содержит буфер соль бикарбонат аммония (NH 4 HCO 3) и фракцию 30-50% органического растворителя (в основном ацетонитрил ). Гидрофобные взаимодействия между белком и CBB уменьшаются за счет органической фракции раствора. В то же время ионная часть раствора уменьшает электростатические связи между красителем и положительно заряженными аминокислотами белок. В отличие от смеси воды с органическим растворителем эффективность обесцвечивания увеличивается. Повышение температуры способствует процессу обесцвечивания. В определенной степени (< 10%) the destaining procedure is accompanied with a loss of protein. Furthermore, the removal of CBB does not affect the yield of пептиды в масс-спектрометрических измерениях.
В случае окрашенных серебром полос белка обесцвечивание осуществляется за счет окисления металлического серебро, присоединенное к белку с помощью феррицианида калия или пероксида водорода (H2O2). Высвободившиеся ионы серебра впоследствии образуют комплекс с помощью тиосульфата натрия.
Окрашивание и обесцвечивание гелей часто с последующим восстановлением и алкилированием (r a) цистинов или цистеинов в белках. Таким образом, дисульфидные связи белков необратимо разрываются, и достигается оптимальное развертывание третичной структуры. Восстановление до тиола осуществляется реакцией с химическими веществами, содержащими сульфгидрильные или фосфиновые группы, такие как дитиотреитол (DTT) или гидрохлорид трис-2-карбоксиэтилфосфина (TCEP). В ходе последующего необратимого алкилирования SH-групп с помощью иодацетамида цистеины превращаются в стабильный S-карбоксамидометилцистеин (CAM; аддукт: -CH 2 -CONH 2). Таким образом, молекулярная масса аминокислотного остатка цистеина увеличивается с 103,01 Да до 160,03 Да.
Восстановление и алкилирование остатков цистеина улучшает выход пептидов и покрытие последовательности, а также идентификацию белков с большим количеством дисульфидных связей. Из-за редкости аминокислоты цистеина для большинства белков этап ra не влияет на улучшение масс-спектрометрического анализа. Для количественного и гомогенного алкилирования цистеинов положение стадии модификации в процессе подготовки образца имеет решающее значение. При денатурирующем электрофорезе настоятельно рекомендуется проводить реакцию до проведения электрофореза, поскольку в геле имеются свободные акриламидные мономеры, способные модифицировать остатки цистеина. необратимо. Полученные акриламидные аддукты имеют молекулярную массу 174,05 Da.
После этого выполняется одноименная стадия способа - расщепление белков в геле. С помощью этой процедуры белок ферментативно разрезают на ограниченное количество более коротких фрагментов. Эти фрагменты называются пептидами и позволяют идентифицировать белок по их характерной массе и структуре. сериновая протеаза трипсин является наиболее распространенным ферментом, используемым в анализе белков. Трипсин разрезает пептидную связь специфически на карбоксильном конце основных аминокислот аргинина и лизина. Если кислая аминокислота, такая как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, находится в непосредственной близости от участка разреза, скорость гидролиза снижается, пролин С-конец к участку разреза полностью подавляет гидролиз.
Нежелательным побочным эффектом использования протеолитических ферментов является самопереваривание протеазы. Чтобы избежать этого, в прошлом к буферу для разложения добавляли ионы Ca. В настоящее время большинство поставщиков предлагают модифицированный трипсин, в котором избирательное метилирование лизинов ограничивает автолитическую активность участками разреза аргинина. Немодифицированный трипсин имеет наивысшую активность при температуре от 35 ° C до 45 ° C. После модификации оптимальная температура изменяется на диапазон от 50 ° C до 55 ° C. Другими ферментами, используемыми для переваривания в геле, являются эндо протеазы и Lys-N. Эти протеазы специфически разрезают только одну аминокислоту, например Asp-N отрезает n-конец аспарагиновой кислоты. Следовательно, получается меньшее количество более длинных пептидов.
Анализ полной первичной последовательности белка с использованием только одной протеазы обычно невозможен. В этих случаях рекомендуется переваривание целевого белка в несколько подходов с разными ферментами. Полученные в результате перекрывающиеся пептиды обеспечивают сборку полной последовательности белка.
Для переваривания протеины, зафиксированные в матрице геля, должны быть доступны для протеазы. Считается, что проникновению фермента в гель способствует дегидратация кусочков геля обработкой ацетонитрилом и последующим набуханием в буфере для переваривания, содержащем протеазу. Эта процедура основана на предположении, что протеаза проникает в гель в процессе набухания. Различные исследования проникновения ферментов в гель показали, что процесс почти полностью осуществляется за счет диффузии. Высыхание геля, похоже, не способствует процессу. Следовательно, улучшение переваривания в геле должно быть достигнуто за счет уменьшения пути фермента к его субстрату, например. разрезав гель на как можно более мелкие кусочки.
Обычно расщепление в геле проводится в течение ночи. Для использования трипсина в качестве протеазы и температуры 37 ° C время инкубации, указанное в большинстве протоколов, составляет 12-15 часов. Однако эксперименты с продолжительностью процесса переваривания показали, что через 3 часа материала достаточно для успешного масс-спектрометрического анализа. Кроме того, оптимизация условий для протеазы по температуре и pH позволяет завершить расщепление образца за 30 мин.
Поверхностно-активное вещество (детергенты) может способствовать солюбилизации и денатурируют белки в геле и тем самым сокращают время переваривания и увеличивают расщепление белков, а также количество и количество экстрагированных пептидов, особенно для липофильных белков, таких как мембранные белки. Расщепляемые детергенты - это детергенты, которые расщепляются после переваривания, часто в кислых условиях. Это делает добавление детергентов совместимым с масс-спектрометрией.
После завершения расщепления пептиды, образующиеся в этом процессе, необходимо экстрагировать из гелевой матрицы. Это выполняется одним или несколькими этапами извлечения. Частицы геля инкубируют с экстракционным раствором и собирают супернатант. При первой экстракции извлекается почти весь пептид, повторение стадии экстракции может увеличить выход всего процесса всего на 5-10%. Для удовлетворения требований к пептидам с различными физическими и химическими свойствами выполняется итеративная экстракция щелочными или кислыми растворами. Для экстракции кислых пептидов используется раствор, близкий по концентрации и составу к буферу для переваривания; основные пептиды экстрагируются в зависимости от предполагаемого масс-спектрометрического метода с помощью низкоконцентрированного кислого раствора муравьиной кислоты для ESI и трифторуксусной кислоты для MALDI соответственно. Исследования на модельных белках показали восстановление примерно 70–80% ожидаемого выхода пептидов при экстракции из геля. Многие протоколы содержат дополнительную фракцию ацетонитрила к раствору для экстракции, который в концентрациях выше 30% (об. / Об.) Эффективен для снижения адсорбции пептидов на поверхности и пипетки советы. Жидкость объединенных экстрактов упаривают в центробежном испарителе . Если летучая соль бикарбонат аммония использовалась для основной экстракции, она частично удаляется в процессе сушки. Высушенные пептиды можно хранить при -20 ° C не менее шести месяцев.
Некоторыми основными недостатками общих протоколов для разложения в геле являются длительное время, необходимое и несколько этапов обработки, что делает метод подверженным ошибкам в отношении загрязнения (особенно кератин ). Эти недостатки были в значительной степени устранены путем разработки оптимизированных протоколов и специализированных реакционных пробирок.
Более серьезными, чем трудности с обращением, являются потери материала при обработке образцов. Масс-спектрометрический анализ белка часто выполняется на пределе обнаружения, поэтому даже небольшие потери могут определять успех или неудачу всего анализа. Эти потери происходят из-за вымывания на различных этапах обработки, адсорбции на поверхности и наконечников пипетки, неполной экстракции пептидов из геля и / или плохой ионизации одиночных пептидов в масс-спектрометре. В зависимости от физико-химических свойств пептидов потери могут варьироваться от 15 до 50%. Из-за присущей пептидам гетерогенности до сих пор не было найдено универсального решения для этого серьезного недостатка метода.
Коммерческие реализации разложения в геле необходимо разделить на продукты для лабораторий с высокой и низкой производительностью.
Из-за очень трудоемкой стандартной процедуры метод расщепления в геле был ограничен относительно небольшим количеством белковых пятен, которые нужно было обработать на время. Поэтому было обнаружено, что это идеальный объект для амбиций автоматизации по преодолению этих ограничений для промышленных и сервисных лабораторий. Сегодня в лабораториях, где разложение в геле проводится в больших количествах, процедура обычно автоматизирована. Степень автоматизации варьируется от простых роботов-дозаторов до сложных комплексных решений, предлагающих автоматизированный рабочий процесс от геля до масс-спектрометрии. Системы обычно состоят из точечного сборщика, робота-пищеварника и корректировщика.
Преимущества автоматизации, отличные от большего количества точек, обрабатываемых одновременно, - это сокращение ручной работы и улучшенная стандартизация. Из-за большого количества этапов обработки, связанных с этим методом, результаты ручного процесса могут варьироваться в зависимости от ловкости пользователя и высокого риска заражения. Таким образом, качество результатов описывается как одно из главных преимуществ автоматизированного процесса.
Недостатками автоматизированных решений являются затраты на роботов, обслуживание и расходные материалы, а также сложная настройка процесса. Поскольку для автоматизированного отбора требуется оцифрованная информация о местоположении пятна, анализ изображения геля для соответствующих пятен должен выполняться с помощью программного обеспечения, требующего стандартизированных методов визуализации и специальных сканеров. Эта длительная процедура предотвращает спонтанное обнаружение исследователем нескольких интересных пятен на одном геле, а также необходимость работы системы на полную мощность. Полученный объем данных в результате последующего автоматического анализа MS - еще одна проблема систем с высокой пропускной способностью, поскольку их качество часто вызывает сомнения, а оценка этих данных занимает значительно больше времени, чем сбор.
Указанные недостатки ограничивают разумное использование автоматизированных систем расщепления в геле рутинной лабораторией, в то время как исследовательская лаборатория, требующая гибкого использования инструментов идентификации белков, чаще использует ручные малопроизводительные методы для расщепление в геле и анализ МС. Эта группа клиентов ориентирована на промышленное производство с несколькими системами наборов для разложения в геле.
Большинство систем наборов представляют собой простые наборы химикатов и ферментов, необходимых для переваривания в геле, тогда как лежащий в основе протокол остается неизменным по сравнению со стандартной ручной процедурой, описанной выше. Преимущество этих продуктов для неопытного заказчика заключается в гарантированном функционировании разнообразных решений в сочетании с готовым протоколом процесса.
Несколько компаний пытались улучшить процесс разложения в геле, чтобы даже при ручной пробоподготовке упростить и стандартизировать рабочий процесс. Набор Montage In-Gel Digest Kit от Millipore основан на стандартном протоколе, но позволяет обрабатывать большое количество параллельных образцов путем передачи работы с кусочками геля на модифицированный 96-луночный микропланшет. Растворы для различных стадий разложения в геле вносятся пипеткой в лунки этого планшета, тогда как удаление жидкости выполняется через дно лунок с помощью вакуумного насоса . Эта система упрощает выполнение нескольких этапов дозирования за счет использования многоканальных пипеток и даже роботов-дозаторов. На самом деле, некоторые производители систем с высокой пропускной способностью адаптировали эту систему для работы со своими роботами. Это иллюстрирует ориентацию данного набора для лабораторий с большим количеством образцов.
