Войти
Plasmodium knowlesi отпечаток гемоглобиназы. Зимография является электрофоретическим метод обнаружения гидролитических ферментов, основанный на репертуаре субстратов фермента. Используются три типа зимографии; в зимографии геля, зимографии in situ и зимографии in vivo Например, желатин, заключенный в полиакриламидный гель, будет расщепляться активными желатиназами, пропущенными через гель. После окрашивания кумасси участки деградации видны в виде четких полос на темном фоне.
Современное использование термина зимография было адаптировано для определения исследования и каталогизация ферментированных продуктов, таких как пиво или вино, часто конкретными пивоварами или виноделами или в рамках определенной категории ферментации, например, с определенным штаммом дрожжей или видами бактерий. Зимография также относится к набору связанных ферментированных продуктов, рассматриваемых как совокупность работ. Например, все сорта пива, произведенные на конкретной пивоварне, в совокупности можно назвать ее зимографией.
См. Также Зимология или прикладная наука зимографии. Зимология относится к биохимическим процессам ферментации, особенно к выделению ферментирующих дрожжей и бактерий в пивоварении, виноделии и других ферментированных продуктах. Например, при производстве пива используются дрожжи верхового (эль) или низового брожения (лагер) для получения желаемого сорта пива. Синтез дрожжей может повлиять на вкусовой профиль пива, то есть на диацетил (вкус или аромат масла, ириски).
Образцы готовят в стандартной, не уменьшение загрузочного буфера для SDS-PAGE. Никакого восстанавливающего агента или кипячения не требуется, поскольку они могут помешать повторной укладке фермента. Подходящий субстрат (например, желатин или казеин для обнаружения протеазы) заделывают в разделяющий гель во время приготовления акриламидного геля. После электрофореза SDS удаляют из геля (или зимограмму ) путем инкубации в небуферизованном Triton X-100 с последующей инкубацией. в соответствующем буфере для разложения в течение оптимального времени при 37 ° C. Затем зимограмма окрашивается (обычно Amido Black или Coomassie Brilliant Blue ), и области пищеварения появляются в виде прозрачных полос на темном фоне, где субстрат был разрушен ферментом..
Стандартный протокол может потребовать изменений в зависимости от фермента образца; например, пищеварительные гликозидазы D. melanogaster обычно выживают в восстанавливающих условиях (т.е. в присутствии 2-меркаптоэтанола или DTT ) и, в некоторой степени, при нагревании. Действительно, разделение после нагревания до 50 ° C имеет тенденцию к значительному увеличению разрешения полос без заметной потери активности.
Обычным протоколом, используемым в прошлом для зимографии активности α-амилазы, был так: называется протоколом крахмальной пленки WW Доан. Здесь использовали нативный гель PAGE для разделения белков в гомогенате. Затем тонкий гель с растворенным (или, точнее, суспендированным) в нем крахмалом накладывали на некоторое время поверх исходного геля. Затем крахмал окрашивали йодом Люголя.
Гелевая зимография часто используется для обнаружения и анализа ферментов, продуцируемых микроорганизмами. Это привело к изменениям в стандартном протоколе, например. Зимография со смешанным субстратом.
Обратная зимография сополимеризует как субстрат, так и фермент с акриламидом, и ее можно использовать для демонстрации активности ингибитора фермента. После окрашивания области подавления визуализируются в виде темных полос на прозрачном (или слегка окрашенном) фоне.
В импринт-технике фермент отделяют с помощью нативного гель-электрофореза и гель кладут на обработанный субстратом агарозу.
Зимография также может применяться к другим типам ферментов, включая ксиланазы, липазы и хитиназы.
