Войти
Вектор выражения, иначе известный как конструкция выражения, обычно является плазмида или вирус, предназначенный для экспрессии гена в клетках. Вектор используется для введения определенного гена в клетку-мишень и может управлять клеточным механизмом синтеза белка для производства белка кодируется геном. Векторы экспрессии являются основными инструментами в биотехнологии для производства белков.
Вектор сконструирован так, чтобы содержать регуляторные последовательности, которые действуют как энхансер и промоторные области и приводят к эффективной транскрипции гена, переносимого в векторе экспрессии. Целью хорошо сконструированного вектора экспрессии является эффективное производство белка, и это может быть достигнуто путем производства значительного количества стабильной матричной РНК, которую затем можно транслировать в белок. Экспрессия белка может строго контролироваться, и белок продуцируется в значительном количестве только при необходимости за счет использования индуктора, однако в некоторых системах белок может экспрессироваться конститутивно. Escherichia coli обычно используется в качестве хозяина для продукции белка, но также могут использоваться другие типы клеток. Примером использования вектора экспрессии является производство инсулина, который используется для лечения диабета.
Вектор экспрессии имеет особенности, которые может иметь любой вектор, такие как источник репликации, выбираемый маркер и подходящий сайт для вставки гена, подобный сайту множественного клонирования. Клонированный ген может быть перенесен из специализированного вектора клонирования в вектор экспрессии, хотя его можно клонировать непосредственно в вектор экспрессии. Процесс клонирования обычно выполняется в Escherichia coli. Векторы, используемые для производства белка в организмах, отличных от E.coli, могут иметь, помимо подходящего источника репликации для его размножения в E.coli, элементы, которые позволяют им сохраняться в другом организме, и эти векторы называются векторы-челноки.
Вектор экспрессии должен иметь элементы, необходимые для экспрессии гена. Они могут включать промотор , правильную последовательность инициации трансляции, такую как сайт связывания рибосомы и стартовый кодон, терминирующий кодон и последовательность терминации транскрипции. Существуют различия в механизмах синтеза белка между прокариотами и эукариотами, поэтому векторы экспрессии должны иметь элементы для экспрессии, которые подходят для выбранного хозяина. Например, векторы экспрессии прокариот будут иметь последовательность Шайна-Дальгарно в своем сайте инициации трансляции для связывания рибосом, тогда как векторы экспрессии эукариот будут содержать консенсусную последовательность Козака.
промотор инициирует транскрипцию и, следовательно, является точкой контроля экспрессии клонированного гена. Промоторы, используемые в векторе экспрессии, обычно являются индуцибельными, что означает, что синтез белка инициируется только при необходимости введением индуктора, такого как IPTG. Однако экспрессия генов также может быть конститутивной (т.е. белок экспрессируется постоянно) в некоторых векторах экспрессии. Низкий уровень конститутивного синтеза белка может иметь место даже в векторах экспрессии с жестко контролируемыми промоторами.
После экспрессии продукта гена может потребоваться очистка экспрессированного белка; однако отделение интересующего белка от подавляющего большинства белков клетки-хозяина может быть длительным процессом. Чтобы упростить этот процесс очистки, к клонированному гену можно добавить тег очистки . Этим тегом может быть тег гистидина (His), другие маркерные пептиды или партнеры слияния, такие как глутатион-S-трансфераза или мальтозосвязывающий белок.. Некоторые из этих партнеров по слиянию могут также помочь увеличить растворимость некоторых экспрессируемых белков. Другие слитые белки, такие как зеленый флуоресцентный белок, могут действовать как репортерный ген для идентификации успешно клонированных генов, или их можно использовать для изучения экспрессии белка при визуализации клеток.
Вектор экспрессии трансформировали или трансфицировали в клетку-хозяин для синтеза белка. Некоторые векторы экспрессии могут иметь элементы для трансформации или встраивания ДНК в хромосому хозяина, например, гены vir для трансформации растений и сайты интегразы для хромосомных интеграция.
Некоторые векторы могут включать нацеливающую последовательность, которая может нацеливать экспрессируемый белок в конкретное место, такое как периплазматическое пространство бактерий.
Для экспрессии целевого белка гена можно использовать разные организмы, и поэтому используемый вектор экспрессии будет иметь элементы, специфичные для использования в конкретном организме. Наиболее часто используемым организмом для продуцирования белка является бактерия Escherichia coli. Однако не все белки могут быть успешно экспрессированы в E.coli или экспрессироваться с правильной формой посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, и поэтому могут использоваться другие системы.
Пример бактериального экспрессирующего вектора - плазмида pGEX-3x . Выборным хозяином для экспрессии многих белков является Escherichia coli, продуцирующая гетерологичный белок в E. coli. относительно простой и удобный, а также быстрый и дешевый. Большое количество плазмид экспрессии E. coli также доступно для самых разных нужд. Другие бактерии, используемые для производства белка, включают Bacillus subtilis.
. Большинство гетерологичных белков экспрессируются в цитоплазме E. coli. Однако не все образованные белки могут быть растворимы в цитоплазме, и неправильно свернутые белки, образованные в цитоплазме, могут образовывать нерастворимые агрегаты, называемые тельцами включения. Такие нерастворимые белки потребуют повторной укладки, что может быть сложным процессом и не обязательно дает высокий выход. Белки, которые имеют дисульфидные связи, часто не могут правильно складываться из-за восстанавливающей среды в цитоплазме, которая предотвращает образование такой связи, и возможное решение состоит в том, чтобы направить белок в периплазматическое пространство с помощью N-концевой сигнальной последовательности. Другая возможность - управлять окислительно-восстановительной средой цитоплазмы. Также разрабатываются другие, более сложные системы; такие системы могут обеспечивать экспрессию белков, ранее считавшихся невозможными в E. coli, таких как гликозилированные белки.
Промоторы, используемые для этих векторов, обычно основаны на промоторе lac оперон или промотор T7, и они обычно регулируются lac оператором. Эти промоторы также могут быть гибридами различных промоторов, например, Tac-Promoter является гибридом промоторов trp и lac. Обратите внимание, что наиболее часто используемые промоторы на основе lac или производных lac основаны на мутанте lacUV5, который нечувствителен к репрессии катаболита. Этот мутант обеспечивает экспрессию белка под контролем промотора lac, когда среда для выращивания содержит глюкозу, поскольку глюкоза будет ингибировать экспрессию гена, если используется промотор lac дикого типа. Тем не менее, присутствие глюкозы может использоваться для снижения фоновой экспрессии за счет остаточного ингибирования в некоторых системах.
Примерами векторов экспрессии E.coli являются векторы серии pGEX, в которых глутатион-S-трансфераза является используется в качестве партнера по слиянию, и экспрессия гена находится под контролем промотора tac, а серия векторов pET, в которой используется промотор T7.
Можно одновременно экспрессировать два или более разные белки в E. coli с использованием разных плазмид. Однако, когда используются 2 или более плазмид, для каждой плазмиды необходимо использовать разные антибиотики, а также разные точки начала репликации, иначе одна из плазмид может не поддерживаться стабильно. Многие широко используемые плазмиды основаны на репликоне ColE1 и поэтому несовместимы друг с другом; для того, чтобы плазмида на основе ColE1 сосуществовала с другой в одной и той же клетке, другая должна быть другого репликона, например плазмида на основе репликона p15A, такая как серия плазмид pACYC. Другой подход заключается в использовании одного двухцистронного вектора или тандемной разработке кодирующих последовательностей в виде би- или полицистронной конструкции.
Дрожжи, обычно используемые для продукции белка, - это Pichia pastoris. Примерами вектора экспрессии дрожжей в Pichia являются векторы серии pPIC, и в этих векторах используется промотор AOX1, который индуцируется метанолом. Плазмиды могут содержать элементы для встраивания чужеродной ДНК в геном дрожжей и сигнальную последовательность для секреции экспрессированного белка. Белки с дисульфидными связями и гликозилированием могут эффективно продуцироваться дрожжами. Другими дрожжами, используемыми для производства белка, являются Kluyveromyces lactis, и этот ген экспрессируется под действием варианта сильного промотора лактазы LAC4.
Saccharomyces cerevisiae особенно широко используется для исследований экспрессии генов в дрожжах, например в дрожжевой двугибридной системе для исследования белок-белкового взаимодействия. Векторы, используемые в дрожжевой двугибридной системе, содержат партнеров слияния для двух клонированных генов, которые позволяют транскрипцию репортерного гена при взаимодействии между двумя белками, экспрессируемыми из клонированных генов.
Бакуловирус, палочковидный вирус, поражающий клетки насекомых, используется в качестве вектора экспрессии в этой системе. В качестве хозяина используют линии клеток насекомых, полученные от Lepidopterans (моли и бабочки), таких как Spodoptera frugiperda. Линия клеток, полученная из петлителя капусты, представляет особый интерес, так как она была разработана для быстрого роста и без дорогостоящей сыворотки, обычно необходимой для ускорения роста клеток. челночный вектор называется бакмидой, и экспрессия гена находится под контролем сильного промотора pPolh. Бакуловирус также использовался с линиями клеток млекопитающих в системе BacMam.
Бакуловирус обычно используется для производства гликопротеинов, хотя гликозилирование может отличаться от найденного. у позвоночных. В целом, его безопаснее использовать, чем вирус млекопитающих, поскольку он имеет ограниченный круг хозяев и не заражает позвоночных без модификаций.
Многие векторы экспрессии растений основаны на Ti плазмиде из Agrobacterium tumefaciens. В этих векторах экспрессии ДНК, которая должна быть вставлена в растение, клонируется в Т-ДНК, участок ДНК, фланкированный последовательностью прямого повтора длиной 25 пар оснований на любом конце, и который может интегрироваться в геном растения.. Т-ДНК также содержит селективный маркер. Agrobacterium обеспечивает механизм трансформации, интеграции в геном растения, и промоторы для его генов vir также могут использоваться для клонированных генов. Однако опасения по поводу переноса бактериального или вирусного генетического материала в растение привели к разработке векторов, называемых внутригенными векторами, в которых используются функциональные эквиваленты генома растения, так что не происходит переноса генетического материала от чужеродных видов в растение.
Вирусы растений можно использовать в качестве векторов, поскольку метод Agrobacterium работает не для всех растений. Примерами используемых вирусов растений являются вирус табачной мозаики (TMV), вирус X картофеля и вирус мозаики коровьего гороха. Белок может быть выражен в виде слияния с белком оболочки вируса и отображается на поверхности собранных вирусных частиц или в виде неслитого белка, который накапливается в растении. Экспрессия в растении с использованием растительных векторов часто является конститутивной, и обычно используемый конститутивный промотор в растительных экспрессионных векторах представляет собой промотор вируса мозаики цветной капусты (CaMV) 35S.
Экспрессионные векторы млекопитающих предлагают значительные преимущества для экспрессии белков млекопитающих по сравнению с бактериальными экспрессионными системами - правильная укладка, посттрансляционные модификации и соответствующая ферментативная активность. Он также может быть более желательным, чем другие эукариотические системы, не относящиеся к млекопитающим, при этом экспрессируемые белки могут не содержать правильного гликозилирования. Он особенно полезен для получения ассоциированных с мембранами белков, которые требуют шаперонов для правильной укладки и стабильности, а также содержат многочисленные посттрансляционные модификации. Обратной стороной, однако, является низкий выход продукта по сравнению с прокариотическими векторами, а также дорогостоящий характер используемых методов. Его сложная технология и возможное заражение вирусами животных экспрессии клеток млекопитающих также наложили ограничения на его использование в крупномасштабном промышленном производстве.
Культивированные линии клеток млекопитающих, такие как яичник китайского хомячка (CHO), COS, включая линии клеток человека, такие как HEK и HeLa, можно использовать для получения белка. Векторы трансфицируют в клетки, и ДНК может быть интегрирована в геном посредством гомологичной рекомбинации в случае стабильной трансфекции, или клетки могут быть трансфицированы временно. Примеры векторов экспрессии млекопитающих включают в себя аденовирусные векторы, плазмидные векторы pSV и pCMV, векторы коровьей оспы и ретровирусные, а также бакуловирус. Промоторы для цитомегаловируса (CMV) и SV40 обычно используются в векторах экспрессии млекопитающих для управления экспрессией генов. Также известен невирусный промотор, такой как промотор фактора элонгации (EF) -1.
E. coli клеточный лизат, содержащий клеточные компоненты, необходимые для транскрипции и трансляции, используются в этом способе получения белка in vitro. Преимущество такой системы состоит в том, что белок может производиться намного быстрее, чем белки, полученные in vivo, поскольку для культивирования клеток не требуется времени, но это также более дорого. В этой системе можно использовать векторы, используемые для экспрессии E. coli, хотя также доступны специально разработанные векторы для этой системы. Экстракты эукариотических клеток также можно использовать в других бесклеточных системах, например, в бесклеточных системах экспрессии зародышей пшеницы. Также были созданы бесклеточные системы млекопитающих.
Вектор экспрессии в экспрессирующем хозяине в настоящее время является обычным методом, используемым в лабораториях для получения белков для исследований.. Большинство белков продуцируется в E. coli, но для гликозилированных белков и белков с дисульфидными связями могут использоваться системы дрожжей, бакуловирусов и млекопитающих.
Большинство белковых фармацевтических препаратов в настоящее время производится с помощью технологии рекомбинантных ДНК с использованием экспрессионных векторов. Эти пептидные и белковые фармацевтические препараты могут быть гормонами, вакцинами, антибиотиками, антителами и ферментами. Первый человеческий рекомбинантный белок, используемый для лечения заболеваний, инсулин, был представлен в 1982 году. Биотехнология позволяет производить эти пептидные и белковые фармацевтические препараты, некоторые из которых ранее были редкими или труднодоступными, производиться в больших количествах. Это также снижает риск заражения такими загрязнителями, как вирусы-хозяева, токсины и прионы. Примеры из прошлого включают загрязнение прионами в гормоне роста, извлеченном из гипофиза, взятых из человеческих трупов, что вызвало болезнь Крейтцфельдта-Якоба в пациенты, получающие лечение от карликовости и вирусных контаминантов в процессе свертывания фактора VIII, выделенного из крови человека, что привело к передаче вирусных заболеваний, таких как гепатит и СПИД. Такой риск снижается или полностью устраняется, когда белки продуцируются не в человеческих клетках-хозяевах.
В последние годы экспрессионные векторы использовались для введения определенных генов в растения и животных с целью получения трансгенных организмов, например, в сельское хозяйство используется для производства трансгенных растений. Векторы экспрессии были использованы для введения предшественника витамина A, бета-каротина в растения риса. Этот продукт называется золотой рис. Этот процесс также использовался для введения в растения гена, производящего инсектицид, называемый токсин Bacillus thuringiensis или токсин Bt, что снижает потребность фермеров в применении инсектициды, так как они производятся измененным организмом. Кроме того, векторы экспрессии используются для увеличения спелости томатов путем изменения растения, чтобы оно производило меньше химического вещества, вызывающего гниение томатов. Существуют противоречия по поводу использования векторов экспрессии для модификации сельскохозяйственных культур из-за того, что могут существовать неизвестные риски для здоровья, возможностей компаний, патентующих определенные генетически модифицированные пищевые культуры, и этических соображений. Тем не менее, этот метод все еще используется и активно исследуется.
Трансгенные животные также были созданы для изучения биохимических процессов животных и болезней человека или использованы для производства фармацевтических препаратов и других белков. Они также могут иметь полезные или полезные свойства. Зеленый флуоресцентный белок иногда используется в качестве меток, в результате чего животные могут флуоресцировать, и это было коммерчески использовано для производства флуоресцентного GloFish.
Генная терапия многообещающее лечение ряда заболеваний, при которых «нормальный» ген, переносимый вектором, вставлен в геном для замены «аномального» гена или дополнения экспрессии конкретного гена. Обычно используются вирусные векторы, но разрабатываются и другие невирусные методы доставки. Лечение по-прежнему является рискованным вариантом из-за используемого вирусного вектора, который может вызывать побочные эффекты, например, вызывать инсерционную мутацию, которая может привести к раку. Однако были получены многообещающие результаты.
