Войти
Структура Ti-плазмиды A индуцирующая опухоль (Ti) плазмида является плазмидой обнаружены у патогенных видов Agrobacterium, включая A. tumefaciens, А. rhizogenes, A. rubi и A. vitis.
Эволюционно плазмида Ti является частью семейства плазмид, переносимых многими видами Alphaproteobacteria. Члены этого семейства плазмид определяются наличием консервативной области ДНК, известной как кассета гена repABC, которая опосредует репликацию плазмиды, разделение плазмиды на дочерние клетки во время деления клеток., а также поддержание низкого числа копий плазмиды в клетке. Сами плазмиды Ti разделены на различные категории в зависимости от типа молекулы, или опина, они позволяют бактериям разрушаться в качестве источника энергии.
Присутствие этой плазмиды Ti важно для бактерий, вызывающих у растений болезнь коронной желчи. Этому способствуют определенные важные области в плазмиде Ti, включая область vir, которая кодирует гены вирулентности, и область переносящей ДНК (Т-ДНК), которая является частью плазмиды Ti, которая является переносили посредством конъюгации в клетки растения-хозяина после того, как место повреждения было обнаружено бактериями. Эти области обладают особенностями, которые позволяют доставлять Т-ДНК в клетки растения-хозяина и могут изменять клетку растения-хозяина, вызывая синтез таких молекул, как гормоны растений (например, ауксины, цитокинины ) и опины и образование опухолей коронного желчного пузыря.
Поскольку область Т-ДНК плазмиды Ti может переноситься от бактерий к клеткам растений, она представляет собой захватывающий путь для переноса ДНК между царствами и стимулировал большое количество исследований плазмида Ti и ее возможное использование в биоинженерии.
Плазмида Ti является членом семейства плазмид, обнаруженных у Alphaproteobacteria. Эти плазмиды часто бывают относительно большими по размеру, от 100 кб до 2 Мбит / с. Их также часто называют репликонами, поскольку их репликация начинается с одного сайта. Члены этого семейства имеют характерную кассету гена repABC. Другим примечательным членом этого семейства является индуцирующая корень (Ri) плазмида, переносимая A. rhizogenes, которая вызывает другое заболевание растений, известное как болезнь волосистого корня.
Ключевой особенностью плазмид Ti является их способность управлять продуцированием опинов, которые являются производными различных аминокислот или сахарных фосфатов в клетках растений-хозяев. Затем эти опины можно использовать в качестве питательного вещества для инфекционных бактерий, которые катаболизируют соответствующие опины с использованием генов, кодируемых в плазмиде Ti.
Соответственно, плазмиды Ti были классифицированы на основе типа опина, который они катаболизируют, а именно: нопалин-, октопин- или типы маннитила, которые являются аминокислотами производные или агроцинопин-типа, которые представляют собой производные фосфата сахара.
Идентификация A. tumefaciens как причины опухолей желчного пузыря у растений открыла путь к пониманию молекулярных основ болезни коронковой желчи.
Первые признаки генетического воздействия на клетки растений-хозяев появились в 1942-1943 годах, когда было обнаружено, что в растительных клетках вторичных опухолей отсутствуют какие-либо бактериальные клетки внутри. Однако эти опухолевые клетки действительно обладали способностью продуцировать опины, метаболизируемые заражающим бактериальным штаммом. Важно отметить, что производство соответствующих опинов происходило независимо от вида растений и иногда только в тканях коронного галла, что указывает на то, что бактерии передали некоторый генетический материал клеткам растения-хозяина, чтобы обеспечить синтез опина.
Однако как и в какой степени произошла передача ДНК, оставалось открытым вопросом. Добавление одной ДНК A. tumefaciens не вызывало опухолей у растений, в то время как было обнаружено, что очень мало ДНК A. tumefaciens интегрировано в геном клетки растения-хозяина. Добавление дезоксирибонуклеаз (ДНКаз) для разрушения ДНК также не смогло предотвратить образование и рост опухолей растений. Они предположили, что небольшая часть ДНК A. tumefaciens передается в клетку растения-хозяина, если вообще передается, чтобы вызвать заболевание, и, если ДНК действительно передается от бактерий к растению, это должно происходить защищенным образом.
Впоследствии было обнаружено, что онкогенные бактериальные штаммы способны превращать непатогенные бактерии в патогенные микроорганизмы посредством процесса конъюгации, при котором гены, ответственные за вирулентность, были перенесены в непатогенные клетки.. Роль плазмиды в этой патогенной способности была дополнительно подтверждена, когда большие плазмиды были обнаружены только у патогенных бактерий, но не у авирулентных бактерий. В конце концов, обнаружение частей бактериальных плазмид в клетках растений-хозяев было установлено, что подтвердило, что это был генетический материал, ответственный за генетический эффект инфекции.
С идентификацией плазмиды Ti было проведено множество исследований для определения характеристик плазмиды Ti и того, как генетический материал переносится от Agrobacterium к растению-хозяину. Некоторые заметные ранние вехи в исследованиях плазмид Ti включают картирование плазмиды Ti в 1978 г. и изучение сходства последовательностей между различными плазмидами Ti в 1981 г.
В период с 1980 по 2000 г. характеристика T-ДНК регион и вирский регион также преследовались. Исследования области Т-ДНК определили процесс их переноса и идентифицировали гены, позволяющие синтезировать растительные гормоны и опины. Отдельно ранняя работа была направлена на определение функций генов, кодируемых в «vir» -области - они были широко разделены на те, которые разрешали взаимодействия бактерий с хозяином, и те, которые обеспечивали доставку Т-ДНК.
Кассета гена repABC Ti плазмид в Agrobacteria со схемой их генного продукта и активностей Репликация, разделение и поддержание Ti плазмиды зависит от repABC генная кассета, которая в основном состоит из трех генов: repA, repB и repC. Каждый из repA и repB кодирует белки, участвующие в разделении плазмиды, в то время как repC кодирует инициатор репликации. Эти гены экспрессируются с 4 разных промоторов, расположенных выше repA. repE кодирует небольшую антисмысловую РНК и располагается между repB и repC. Кроме того, в кассете repABC присутствует сайт разделения (parS) и точка начала репликации (oriV).
Репликация плазмиды Ti управляется белком-инициатором RepC, который имеет два белковых домена : N-конец домен (NTD), который связывается с ДНК, и C-концевой домен (CTD). Мутационный анализ показал, что без функционального белка RepC плазмида Ti не может реплицироваться. Между тем, последовательность oriV имеет длину около 150 нуклеотидов и находится в гене repC. Лабораторные эксперименты показали, что белок RepC связывается с этой областью, что свидетельствует о его роли в качестве источника репликации. Следовательно, хотя полный процесс репликации плазмиды Ti не был полностью описан, начальный этап репликации, вероятно, будет зависеть от экспрессии RepC и его связывания с oriV. Следует отметить, что белок RepC действует только в цис-системе, где он управляет только репликацией плазмиды, в которой он кодируется, а не какой-либо другой плазмиды, также присутствующей в бактериальной клетке.
| Компонент | Функция |
|---|---|
| RepA (ParA) | Слабая АТФаза, которая отрицательно ауторегулирует экспрессию кассеты repABC и может образовывать филаменты, способствующие разделению плазмиды во время деления клетки |
| RepB (ParB) | ДНК-связывающий белок, который служит адаптером между RepA и сайтом parS |
| parS | Сайт связывания для белка ParB |
система разделения плазмиды Ti аналогична системе ParA / ParB, используемой в других плазмидах и бактериальных хромосомах, и считается, что она действует таким же образом. Мутации в любом из белков RepA или RepB привели к снижению стабильности плазмиды, что указывает на их роль и важность в разделении плазмиды. Способность RepA образовывать филаменты позволяет ему создавать физический мост, по которому ДНК может тянуться к противоположным полюсам делящейся клетки. Между тем, белок RepB может специфически связываться с последовательностью parS, образуя комплекс с ДНК, который может распознаваться RepA. Эта система особенно важна для правильного разделения плазмиды Ti, поскольку плазмида присутствует только в небольшом количестве копий в бактериальной клетке.
Ti-плазмида поддерживается с низким числом копий в бактериальной клетке. Частично это достигается путем влияния на экспрессию инициатора репликации RepC. При привязке к ADP RepA активируется для работы с RepB, действуя как отрицательный регулятор кассеты repABC. Таким образом, уровни RepC в клетке поддерживаются на низком уровне, что предотвращает возникновение слишком большого количества циклов репликации во время каждого цикла деления клетки. Кроме того, существует малая РНК, известная как RepE, кодируемая между repB и repC, которая снижает экспрессию repC. RepE комплементарен RepC и будет связываться с мРНК repC с образованием двухцепочечной молекулы. Затем это может блокировать трансляционную продукцию белка RepC.
Отдельно на экспрессию кассеты repABC и, следовательно, количество копий плазмиды Ti также влияет система распознавания кворума в Agrobacterium. Системы контроля кворума реагируют на плотность бактериальной популяции, воспринимая молекулу, известную как аутоиндуктор, которая продуцируется бактериальными клетками на низких уровнях и достигает порогового уровня, когда присутствует высокая плотность бактерий. В этом случае аутоиндуктором является молекула N-3-оксооктаноил-L-гомосеринлактон (3-O-C 8 -AHL), которая воспринимается регулятором, известным как TraR. При активации TraR будет связываться с областями, известными как traboxs в промоторных областях кассеты гена repABC, для управления экспрессией. Следовательно, высокий уровень плотности популяции увеличивает количество плазмид, присутствующих в каждой бактериальной клетке, что, вероятно, поддерживает патогенез в растении-хозяине.
Состав vir-области Ti-плазмид октопинового типа Экспрессия vir-области обычно подавляется в нормальных условиях и только активируется когда бактерии улавливают сигналы растений от ран. Эта активация необходима для производства белков Vir и переноса ДНК и белков в клетки растения-хозяина.
VirA и VirG образуют двухкомпонентную регуляторную систему внутри Agrobacterium. Это тип сенсорной и сигнальной системы, обычно встречающейся у бактерий; в этом случае они действуют, воспринимая сигналы растительного происхождения, чтобы управлять экспрессией области vir. Во время зондирования VirA, гистидиновая сенсорная киназа, будет фосфорилироваться перед передачей этой фосфатной группы регулятору ответа VirG. Затем активированный регулятор ответа VirG может связываться с областью ДНК, известной как vir-бокс, расположенной выше каждого промотора vir, для активации экспрессии области vir. Одной из возможных нижестоящих функций восприятия, опосредованной VirA и VirG, является направленное движение или хемотаксис бактерий в направлении сигналов растительного происхождения; это позволяет Agrobacterium продвигаться к месту раны растений. Кроме того, с индукцией области vir перенос Т-ДНК может опосредоваться белками Vir.
Оперон virB является крупнейшим опероном в области vir, кодирующим 11 белков VirB, участвующих в процессе переноса Т-ДНК и бактериальных белков в клетки растения-хозяина (см. Устройство для переноса ниже).
Оперон virC кодирует два белка: VirC1 и VirC2. Эти белки влияют на патогенез Agrobacterium по отношению к различным растениям-хозяевам, и мутации могут снижать, но не устранять вирулентность бактерий. Опероны virC и virD могут быть репрессированы хромосомно-кодируемым белком, известным как Ros. Ros связывается с областью ДНК, которая перекрывается с сайтом связывания регулятора VirG, и поэтому конкурирует с VirG за контроль уровня их экспрессии. Функционально VirC1 и VirC2 способствуют сборке комплекса релаксосомы во время конъюгативного переноса Т-ДНК от бактерий к клетке растения-хозяина. Это энергозависимый процесс, опосредованный их активностью NTPase, и происходит, когда они связываются с областью ДНК, известной как перегрузка. В результате они увеличивают количество продуцируемых цепей Т-ДНК. После образования переносимой цепи ДНК (транспортная цепь, Т-цепь) белки VirC также могут помочь направить переносящую цепь в устройство для переноса.
Оперон virD кодирует 4 белка: VirD1-D4. VirD1 и VirD2 участвуют в процессинге Т-ДНК во время конъюгации с образованием Т-цепи; это одноцепочечная молекула ДНК, которая транспортируется в клетку растения-хозяина (см. устройство для переноса ниже). Во время обработки VirD1 будет действовать как топоизомераза, раскручивая цепи ДНК. VirD2, релаксаза, затем разрывает одну из цепей ДНК и остается связанной с ДНК, когда она переносится в реципиентную клетку. Внутри клетки-реципиента VirD2 также будет работать вместе с VirE2, направляя переданную ДНК в ядро клетки-реципиента. Есть предположения, что VirD2 может фосфорилироваться и дефосфорилироваться различными белками, что влияет на его способность доставлять ДНК. Напротив, о VirD3 известно мало, и мутационные анализы не подтвердили его роль в вирулентности Agrobacterium. Наконец, VirD4 является важной частью процесса конъюгации, выступая в качестве фактора связи, который распознает и передает Т-цепь в транспортный канал.
Оперон virE кодирует 2 белка: VirE1 и VirE2. VirE2 - это эффекторный белок, который вместе с Т-цепью перемещается в клетки растения-хозяина. Там он связывается с Т-цепью, чтобы направлять ее доставку в ядро клетки растения-хозяина. Часть этой активности включает присутствие последовательностей ядерной локализации внутри белка, которые маркируют белок и связанную ДНК для проникновения в ядро. Он также защищает Т-цепь от атаки нуклеазой. Есть некоторые предположения относительно роли VirE2 как белкового канала, позволяющего ДНК перемещаться через цитоплазматическую мембрану растения . С другой стороны, VirE1 может участвовать в обеспечении переноса белка VirE2 в клетку растения-хозяина. Он связывается с ssDNA-связывающим доменом VirE2, тем самым предотвращая преждевременное связывание белка VirE2 с Т-цепью внутри бактериальной клетки.
virF представляет собой фактор специфичности хозяина, обнаруживаемый в некоторых, но не во всех типах плазмид Ti; например, Ti-плазмиды октопинового типа обладают virF, а нопалиновые - нет. Способность A. tumefaciens вызывать опухоли венозного желчного пузыря у некоторых видов растений, но не у других, была приписана присутствию или отсутствию этого гена virF.
Оперон virH кодирует 2 белка: VirH1 и VirH2. Исследование биоинформатики аминокислотных последовательностей белка VirH показало сходство между ними и суперсемейством белков, известных как ферменты цитохрома P450. Затем было обнаружено, что VirH2 метаболизирует определенные фенольные соединения, обнаруженные VirA.
Т-ДНК Agrobacterium имеет длину примерно 15-20 т.п.н. и будет интегрирована в геном растения-хозяина после ее передачи посредством процесса, известного как рекомбинация. Этот процесс использует уже существующие пробелы в геноме клетки растения-хозяина, чтобы позволить Т-ДНК спариваться с короткими последовательностями в геноме, инициируя процесс лигирования ДНК, при котором Т-ДНК постоянно соединяется с растением. геном. Область Т-ДНК фланкирована с обоих концов последовательностями длиной 24 п.н.
В геноме клетки растения-хозяина Т-ДНК Agrobacterium экспрессируется с образованием двух основных групп белков. Одна группа отвечает за производство гормонов роста растений. Поскольку эти гормоны вырабатываются, будет увеличиваться скорость деления клеток и, следовательно, образование опухолей коронного желчного пузыря. Вторая группа белков отвечает за синтез опинов в клетках растения-хозяина. Конкретные продуцируемые опины зависят от типа плазмиды Ti, но не от растения-хозяина. Эти опины не могут быть использованы растением-хозяином, а вместо этого будут экспортироваться из растительной клетки, где они могут быть поглощены клетками Agrobacterium. Бактерии обладают генами в других областях плазмиды Ti, что делает возможной катаболизм опинов.
Устройства для переноса, кодируемые в плазмиде Ti, должны достигать двух целей: обеспечить конъюгативный перенос плазмиды Ti между бактериями и обеспечить доставку Т-ДНК и некоторых эффекторных белков. в клетки растения-хозяина. Это достигается с помощью системы Tra / Trb и системы VirB / VirD4, соответственно, которые являются членами системы секреции типа IV (T4SS).
Для переноса Ti-плазмиды и Т-ДНК посредством конъюгации они должны сначала обработаться различными белками, такими как фермент релаксаза (TraA / VirD2) и белки переноса и репликации ДНК (Dtr). Вместе эти белки будут распознавать и связываться с областью, известной как начало переноса (oriT) в плазмиде Ti, с образованием комплекса релаксосом. Для Т-ДНК разрыв будет создан в пограничной последовательности Т-ДНК, и разрезанная Т-цепь будет транспортироваться к клеточной мембране, где присутствует остальная часть механизма переноса.
В системе VirB / VirD4 релаксазе VirD2 помогают дополнительные факторы VirD1, VirC1 и VirC2, пока она обрабатывает субстрат ДНК. Кроме того, релаксаза VirD2 и белки VirC будут вносить вклад в доставку цепи ДНК к рецептору VirD4 на клеточной мембране. Этот рецептор является важным компонентом T4SS, и считается, что он активирует и опосредует перенос ДНК в канал транслокации между двумя клетками. В таблице ниже представлены белки, кодируемые опероном virB, который составляет канал транслокации системы VirB / VirD4.
| Белок (белки) | Функция |
|---|---|
| VirB4, VirB11 | АТФазы, обеспечивающие энергию для переноса ДНК |
| VirB3, VirB6, VirB8 | Субъединицы предполагаемая внутренняя мембрана транслоказа |
| VirB7, VirB9, VirB10 | Образует основной комплекс, который стабилизирует субъединицы канала |
| VirB2 | Главный пилин субъединица конъюгативной пилуса |
| VirB1, VirB5 | Минорные компоненты конъюгативной пилуса |
Способность Agrobacterium доставлять ДНК в клетки растений открыла новые возможности двери для растений геномной инженерии, позволяющие производить генетически модифицированные растения (трансгенные растения). Белки, участвующие в передаче Т-ДНК, сначала узнают пограничные последовательности области Т-ДНК. Следовательно, ученые могут использовать пограничные последовательности Т-ДНК для фланкирования любой желаемой интересующей последовательности - такой продукт затем можно вставить в плазмиду и ввести в клетки Agrobacterium. Там пограничные последовательности будут распознаваться устройством переноса A. tumefaciens и доставляться стандартным способом в целевую растительную клетку. Более того, если оставить только граничные последовательности Т-ДНК, полученный продукт будет редактировать геном растения, не вызывая опухолей у растений. Этот метод был использован для модификации нескольких сельскохозяйственных культур, включая рис, ячмень и пшеницу. Дальнейшие исследования с тех пор расширили мишени A. tumefaciens, включив в них грибки и клеточные линии человека.
