Войти
Плазмида Ti с областью Т-ДНК Перенос ДНК (сокращенно Т- ДНК ) представляет собой перенесенную ДНК индуцирующей опухоль (Ti) плазмиды некоторых видов бактерий, таких как Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes (фактически плазмида Ri). Т-ДНК переносится из бактерии в ядерную ДНК генома растения-хозяина. Способность этой специализированной плазмиды индуцировать опухоль (Ti) приписывается двум основным областям, необходимым для переноса ДНК в клетку-хозяин. Поскольку Т-ДНК ограничена повторами из 25 пар оснований на каждом конце. Перенос инициируется на правой границе и заканчивается на левой границе и требует генов vir из плазмиды Ti.
Бактериальная Т-ДНК имеет длину около 24 000 пар оснований и содержит гены, которые кодируют ферменты, синтезирующие опины и фитогормоны. Перенося Т-ДНК в геном растения, бактерия по существу перепрограммирует клетки растения, чтобы превратиться в опухоль и произвести уникальный источник пищи для бактерий. Синтез растительных гормонов ауксина и цитокинина ферментами, кодируемыми в Т-ДНК, позволяет растительной клетке бесконтрольно расти, таким образом, обычно образуя опухоли коронной галлы вызвано инфекцией Agrobacterium tumefaciens. Agrobacterium rhizogenes вызывает аналогичную инфекцию, известную как болезнь волосистого корня. опины представляют собой производные аминокислот, которые используются бактериями в качестве источника углерода и энергии. Этот естественный процесс горизонтального переноса генов в растениях используется в качестве инструмента для фундаментальных и прикладных исследований в биологии растений посредством трансформации чужеродных генов и инсерционного мутагенеза, опосредованной Agrobacterium tumefaciens. Геномы растений могут быть сконструированы с использованием Agrobacterium для доставки последовательностей, содержащихся в бинарных векторах Т-ДНК.
Опосредованный агробактериями перенос Т-ДНК широко используется в качестве инструмента биотехнологии. Более двух десятилетий Agrobacterium tumefaciens использовалась для введения генов в растения для фундаментальных исследований, а также для коммерческого производства трансгенных культур. В генной инженерии гены, способствующие развитию опухоли, и гены синтеза опина удаляются из Т-ДНК и заменяются представляющим интерес геном и / или селективным маркером, который требуется для установления того, какие растения были успешными. преобразован. Примеры маркеров селекции включают (которые фосфорилируют антибиотики) и фосфинотрицинацетилтрансферазу (которая ацетилирует и дезактивирует фосфинотрицин, мощный ингибитор глутаминсинтетазы ) или гербицидные составы, такие как Баста или Биалофос. Другая система отбора, которую можно использовать, - это использование метаболических маркеров, таких как изомераза фосфоманнозы. Затем Agrobacterium используется в качестве вектора для переноса сконструированной Т-ДНК в клетки растений, где она интегрируется в геном растения. Этот метод можно использовать для создания трансгенных растений, несущих чужеродный ген. Agrobacterium tumefaciens способна эффективно переносить чужеродную ДНК как в однодольные, так и в двудольные растения, при этом заботясь о критически важных факторах, таких как генотип растений, типы и возраст инокулированных тканей, виды векторов, штаммы Agrobacterium, гены селекционных маркеров и селективные агенты, а также различные условия культивирования тканей.
Процесс инфицирования Т-ДНК в клетке-хозяине и интеграция в ее ядро включает несколько шаги. Сначала бактерии размножаются в раневом соке до заражения, а затем прикрепляются к стенкам клеток растений. Экспрессия генов бактериальной вирулентности примерно 10 оперонов активируется восприятием фенольных соединений, таких как ацетосирингон, выделяемых поврежденной растительной тканью, и следует за межклеточным контактом. Затем этот процесс следует за макромолекулярной транслокацией из Agrobacterium в цитоплазму клетки-хозяина, передачей Т-ДНК вместе с ассоциированными белками (так называемый Т-комплекс ) в ядро клетки-хозяина с последующей разборкой Т-комплекса, стабильной интеграцией Т-ДНК в геном растения-хозяина и экспрессией перенесенных генов. Интеграция Т-ДНК в геном хозяина включает образование разрыва на правом краю плазмиды Ti. Этот разрыв создает область одноцепочечной ДНК от левой границы гена Т-ДНК до правой границы, которая была разрезана. Затем одноцепочечные связывающие белки присоединяются к одноцепочечной ДНК. Синтез ДНК смещает одноцепочечный участок, а затем второй разрыв в левой пограничной области высвобождает одноцепочечный фрагмент Т-ДНК. Кроме того, этот фрагмент может быть включен в геном хозяина.
Известно, что Agrobacterium разработала систему контроля, которая захватывает факторы хозяина и клеточные процессы для нескольких путей защитной реакции растения-хозяина для вторжения в ядро клетки-хозяина. Для интеграции Т-ДНК в геном-мишень-хозяин Agrobacterium осуществляет множественные взаимодействия с факторами растения-хозяина. Для взаимодействия с белками растений-хозяев многие белки вирулентности Agrobacterium кодируются генами vir. Экспрессия генов Agrobacterium vir происходит через датчик VirA-VirG, что приводит к генерации мобильной одноцепочечной копии Т-ДНК (Т-цепи). Обработанная форма VirB2 является основным компонентом Т-комплекса, который необходим для трансформации. VirD2 представляет собой белок, который закрывает 5'-конец перенесенной Т-цепи путем ковалентного присоединения и транспортируется в цитоплазму клетки-хозяина. VirE2 представляет собой одноцепочечный ДНК-связывающий белок, который предположительно покрывает Т-цепь в цитоплазме хозяина за счет кооперативного связывания. Затем он направляется в ядро посредством взаимодействия с белками клетки-хозяина, такими как импортин А, бактериальный VirE3 и динеиноподобные белки. Некоторые другие эффекторы бактериальной вирулентности, такие как VirB5, VirB7 (второстепенные компоненты Т-комплекса), VirD5, VirE2, VirE3 и VirF, которые также могут взаимодействовать с белками клеток растений-хозяев.
Та же процедура переноса Т-ДНК может быть использована для разрушения генов посредством инсерционного мутагенеза. Вставленная последовательность Т-ДНК не только создает мутацию, но также «маркирует» пораженный ген, что позволяет его изолировать. Репортерный ген может быть связан с правым концом Т-ДНК для трансформации вместе с репликоном плазмиды и геном устойчивости к селектируемым антибиотикам (например, гигромицину ) и может проявлять примерно 30% средней эффективности. наличие успешных вставок Т-ДНК, индуцированных слиянием генов у Arabidopsis thaliana.
Обратной генетикой обычно придерживаются как функциональный геномный подход, основанный на динамике биологической системы, которая направлена на назначение функции (-ов)) к генам и определяет, как гены и их продукты взаимодействуют друг с другом. Трансгенные методы, включающие скрининг популяций с помощью инсерционного мутагенеза Т-ДНК, являются одним из эффективных способов изучения потери функции и эктопической экспрессии, чтобы назначить эту функцию исследуемому гену. Следовательно, этот метод широко используется для изучения функции генов у растений, таких как модельное растение Arabidopsis thaliana. При изучении вставки Т-ДНК для нарушения гена мутанты Arabidopsis thaliana могут также демонстрировать различные фенотипические классы, такие как летальные всходы, варианты размера, пигмент, дефектный эмбрион, сниженная фертильность, драматический (морфологический) и физиологический. Например, эта стратегия разрушения гена, используемая для присвоения функций генам, определяемым только последовательностью, помогла продемонстрировать встраивание En-1 в ген флаванон-3-гидроксилазы (F3H). Нокаут-аллели вставки En-1 в ген флавонолсинтазы (FLS) были охарактеризованы этим обратным генетическим подходом, который резко снизил уровни кемпферола.
