Войти
SYBR Green диаграмма флуоресценции, полученная с помощью ПЦР в реальном времени 
Кривая плавления, полученная в конце ПЦР в реальном времени A полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР в реальном времени ), также известная как количественная полимеразная цепная реакция (qPCR ), представляет собой лабораторный метод молекулярной биологии, основанный на полимеразной цепной реакции (ПЦР). Он отслеживает амплификацию целевой молекулы ДНК во время ПЦР (т. Е. В реальном времени), а не в конце, как в обычной ПЦР. ПЦР в реальном времени может использоваться количественно (количественная ПЦР в реальном времени) и полуколичественно (т.е. выше / ниже определенного количества молекул ДНК) (полуколичественная ПЦР в реальном времени).
Двумя общими методами обнаружения продуктов ПЦР в ПЦР в реальном времени являются (1) неспецифические флуоресцентные красители, которые интеркалируют с любой двухцепочечной ДНК и (2) специфичные к последовательности ДНК-зонды, состоящие из олигонуклеотидов, меченных флуоресцентным репортером, что позволяет обнаруживать только после гибридизации зонд с его комплементарной последовательностью.
В руководстве Минимум информации для публикации количественных экспериментов ПЦР в реальном времени (MIQE) предлагается использовать аббревиатуру qPCR для количественной ПЦР в реальном времени и использовать RT-qPCR для обратного транскрипция – КПЦР. Акроним «ОТ-ПЦР» обычно обозначает полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией, а не ПЦР в реальном времени, но не все авторы придерживаются этого соглашения.
ПЦР в реальном времени использует флуорофоры для определения уровней экспрессии генов.Клетки всех организмов регулируют экспрессия гена по обороту транскриптов гена (одноцепочечная РНК ): количество экспрессии ed гена в клетке можно измерить по количеству копий транскрипта РНК этого гена, присутствующего в образце. Для надежного обнаружения и количественной оценки экспрессии гена из небольших количеств РНК необходима амплификация транскрипта гена. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - распространенный метод амплификации ДНК; для ПЦР на основе РНК образец РНК сначала подвергается обратной транскрипции в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью обратной транскриптазы.
. Для амплификации небольших количеств ДНК используется та же методология, что и в обычная ПЦР с использованием ДНК-матрицы, по крайней мере, одной пары конкретных праймеров, дезоксирибонуклеотидов, подходящего буферного раствора и термостабильной ДНК-полимеразы. Вещество, помеченное флуорофором, добавляется к этой смеси в термоциклере, который содержит датчики для измерения флуоресценции флуорофора после он возбуждается на требуемой длине волны, что позволяет измерить скорость генерации для одного или нескольких конкретных продуктов. Это позволяет измерять скорость образования амплифицированного продукта в каждом цикле ПЦР. Полученные таким образом данные можно проанализировать с помощью компьютерного программного обеспечения для расчета относительной экспрессии гена (или числа копий мРНК) в нескольких образцах. Количественная ПЦР также может применяться для обнаружения и количественного определения ДНК в образцах, чтобы определить присутствие и количество конкретной последовательности ДНК в этих образцах. Это измерение выполняется после каждого цикла амплификации, и поэтому этот метод называется ПЦР в реальном времени (то есть немедленной или одновременной ПЦР). В случае количественного определения РНК матрицей является комплементарная ДНК (кДНК), которая получается путем обратной транскрипции рибонуклеиновой кислоты (РНК). В этом случае используется метод количественной RT-PCR или Q-RT-PCR.
Количественная ПЦР и ДНК-микрочип - это современные методологии изучения экспрессии генов. Для измерения содержания мРНК использовали более старые методы: Дифференциальный дисплей, Анализ защиты от РНКазы и Нозерн-блот. Нозерн-блоттинг часто используется для оценки уровня экспрессии гена путем визуализации количества транскрипта его мРНК в образце. В этом методе очищенную РНК разделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, переносят на твердую матрицу (например, нейлоновую мембрану) и исследуют с помощью специфического зонда ДНК или РНК, который комплементарный интересующему гену. Хотя этот метод до сих пор используется для оценки экспрессии генов, он требует относительно большого количества РНК и предоставляет только качественную или полуколичественную информацию об уровнях мРНК. Ошибки оценки, возникающие из-за различий в методе количественной оценки, могут быть результатом целостности ДНК, эффективности фермента и многих других факторов. По этой причине был разработан ряд систем стандартизации (часто называемых методами нормализации ). Некоторые из них были разработаны для количественной оценки общей экспрессии гена, но наиболее распространенные нацелены на количественную оценку конкретного изучаемого гена по отношению к другому гену, называемому нормализующим геном, который выбран по почти постоянному уровню экспрессии. Эти гены часто выбирают из генов домашнего хозяйства, поскольку их функции, связанные с основным клеточным выживанием, обычно подразумевают конститутивную экспрессию генов. Это позволяет исследователям сообщать соотношение экспрессии интересующих генов, деленное на экспрессию выбранного нормализатора, тем самым позволяя сравнивать первый, фактически не зная его абсолютного уровня экспрессии.
Наиболее часто используемые нормализующие гены - это те, которые кодируют следующие молекулы: тубулин, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, альбумин, циклофилин и рибосомные РНК.
ПЦР в реальном времени проводится в термоциклере, способном освещать каждый образец луч света по меньшей мере одной указанной длины волны и детектировать флуоресценцию, испускаемую возбужденным флуорофором. Термоциклер также может быстро нагревать и охлаждать образцы, тем самым используя физико-химические свойства нуклеиновых кислот и ДНК-полимеразы.
. Процесс ПЦР обычно состоит из серии изменений температуры. которые повторяются 25–50 раз. Эти циклы обычно состоят из трех стадий: первая, при температуре около 95 ° C, позволяет разделить двойную цепь нуклеиновой кислоты; второй, при температуре около 50–60 ° C, позволяет связывать праймеры с матрицей ДНК; третий, при температуре 68–72 ° C, способствует полимеризации, осуществляемой ДНК-полимеразой. Из-за небольшого размера фрагментов последний этап обычно пропускается в этом типе ПЦР, поскольку фермент может увеличивать их количество во время перехода между этапом выравнивания и этапом денатурирования. Кроме того, в четырехэтапной ПЦР флуоресценция измеряется во время коротких температурных фаз, продолжающихся всего несколько секунд в каждом цикле, при температуре, например, 80 ° C, чтобы уменьшить сигнал, вызванный присутствием димеров праймеров. когда используется неспецифический краситель. Температура и время, используемые для каждого цикла, зависят от широкого спектра параметров, таких как: фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрация двухвалентных ионов и дезоксирибонуклеотидов (dNTP) в реакции и связывания температура грунтовок. h
Методика ПЦР в реальном времени может быть классифицирована по химии, используемой для обнаружения продукта ПЦР, специфических или неспецифических флуорохромов.
ДНК-связывающий краситель связывается со всеми двухцепочечными (ds) ДНК в ПЦР, увеличивая квантовый выход флуоресценции красителя. Поэтому увеличение количества продукта ДНК во время ПЦР приводит к увеличению интенсивности флуоресценции, измеряемой в каждом цикле. Однако красители дцДНК, такие как SYBR Green, будут связываться со всеми продуктами ПЦР дцДНК, включая неспецифические продукты ПЦР (такие как димер праймера ). Это потенциально может помешать или помешать точному мониторингу намеченной целевой последовательности.
В ПЦР в реальном времени с красителями дцДНК реакцию готовят как обычно, с добавлением флуоресцентного красителя дцДНК. Затем реакцию проводят в приборе для ПЦР в реальном времени, и после каждого цикла интенсивность флуоресценции измеряется детектором; краситель флуоресцирует только при связывании с дцДНК (т.е. с продуктом ПЦР). Преимущество этого метода состоит в том, что для проведения амплификации требуется только пара праймеров, что снижает затраты; несколько последовательностей-мишеней можно контролировать в пробирке с использованием различных типов красителей.
(1) В интактных зондах репортерная флуоресценция гасится. (2) Зонды и комплементарная цепь ДНК гибридизуются, и флуоресценция репортера все еще гасится. (3) Во время ПЦР зонд разрушается полимеразой Taq и высвобождается флуоресцентный репортер. Флуоресцентные репортерные зонды обнаруживают только ДНК, содержащую последовательность, комплементарную зонду; следовательно, использование репортерного зонда значительно увеличивает специфичность и позволяет выполнять методику даже в присутствии другой дцДНК. Используя разноцветные метки, флуоресцентные зонды можно использовать в мультиплексных анализах для мониторинга нескольких целевых последовательностей в одной пробирке. Специфичность флуоресцентных репортерных зондов также предотвращает вмешательство в измерения, вызванное димерами праймера, которые являются нежелательными потенциальными побочными продуктами в ПЦР. Однако флуоресцентные репортерные зонды не предотвращают ингибирующее действие димеров праймеров, которое может подавлять накопление желаемых продуктов в реакции.
В этом методе используется зонд на основе ДНК с флуоресцентным репортером на одном конце и гасителем флуоресценции на противоположном конце зонда. Непосредственная близость репортера к тушителю предотвращает обнаружение его флуоресценции; разрушение зонда с помощью 5 '- 3' экзонуклеазы активности Taq-полимеразы нарушает близость репортер-тушитель и, таким образом, обеспечивает непогашенное излучение флуоресценции, которое может быть обнаружено после возбуждение лазером. Таким образом, увеличение количества продукта, нацеленного репортерным зондом, в каждом цикле ПЦР вызывает пропорциональное увеличение флуоресценции из-за разрушения зонда и высвобождения репортера.
Четкие кривые слияния для ряда продуктов ПЦР (показывающие разные цвета). Можно увидеть реакции амплификации для определенного продукта (розовый, синий) и других с отрицательным результатом (зеленый, оранжевый). Пик слияния, обозначенный стрелкой, показывает пик, вызванный димерами праймеров, который отличается от ожидаемого продукта амплификации. ПЦР в реальном времени позволяет идентифицировать специфические амплифицированные фрагменты ДНК с использованием анализа их температуры плавления (также называемое значением T m, исходя из температуры плавления). Используемый метод обычно представляет собой ПЦР с двухцепочечными ДНК-связывающими красителями в качестве репортеров, а используемый краситель - обычно SYBR Green. Температура плавления ДНК специфична для амплифицированного фрагмента. Результаты этого метода получены путем сравнения кривых диссоциации проанализированных образцов ДНК.
В отличие от традиционной ПЦР, этот метод позволяет избежать предыдущего использования методов электрофореза для демонстрации результатов всех образцы. Это потому, что, несмотря на то, что это кинетический метод, количественная ПЦР обычно оценивается в определенной конечной точке. Поэтому метод обычно обеспечивает более быстрые результаты и / или использует меньше реагентов, чем электрофорез. Если требуется последующий электрофорез, необходимо протестировать только те образцы, которые оказались сомнительными при ПЦР в реальном времени, и / или утвердить результаты для образцов, которые дали положительный результат на определенный детерминант.
В отличие от ПЦР по конечной точке (традиционной ПЦР), ПЦР в реальном времени позволяет контролировать желаемый продукт в любой момент процесса амплификации путем измерения флуоресценции (в реальном масштабе времени измерение выполняется его уровня выше заданного порога). Обычно используемый метод количественного определения ДНК с помощью ПЦР в реальном времени основан на построении графика зависимости флуоресценции от количества циклов в логарифмической шкале. Порог обнаружения флуоресценции на основе ДНК устанавливается в 3–5 раз от стандартного отклонения шумового сигнала над фоном. Количество циклов, при которых флуоресценция превышает порог, называется пороговым циклом (C t) или, в соответствии с рекомендациями MIQE, циклом количественного определения (Cq).
Во время фазы экспоненциальной амплификации количество мишени Матрица ДНК (ампликон) удваивается каждый цикл. Например, образец ДНК, у которого C q предшествует таковому у другого образца на 3 цикла, содержал в 2 = 8 раз больше матрицы. Однако эффективность амплификации часто варьируется среди праймеров и матриц. Следовательно, эффективность комбинации праймер-матрица оценивается в эксперименте по титрованию с последовательными разведениями ДНК-матрицы для создания стандартной кривой изменения (Cq) при каждом разведении. Наклон линейной регрессии затем используется для определения эффективности амплификации, которая составляет 100%, если разведение 1: 2 приводит к разнице (Cq), равной 1. Метод порога цикла делает несколько предположений о механизме реакции и полагается на данные из областей с низким отношением сигнал-шум профиля амплификации, которые могут вносить существенные различия во время анализа данных.
Для количественной оценки экспрессии гена (Cq) для РНК или ДНК из интересующего гена вычитается из (Cq) РНК / ДНК из гена домашнего хозяйства в том же образце, чтобы нормализовать различия в количестве и качестве РНК между разными образцами. Эта процедура нормализации обычно называется ΔC t -методом и позволяет сравнивать экспрессию интересующего гена среди различных образцов. Однако для такого сравнения экспрессия нормализующего эталонного гена должна быть очень похожей во всех образцах. Поэтому выбор эталонного гена, отвечающего этому критерию, очень важен и часто является сложной задачей, поскольку лишь очень немногие гены демонстрируют одинаковые уровни экспрессии в различных условиях или тканях. Хотя анализ пороговых значений цикла интегрирован со многими коммерческими программными системами, существуют более точные и надежные методы анализа данных профиля амплификации, которые следует учитывать в случаях, когда воспроизводимость является проблемой.
Методы количественной оценки количественной ПЦР на основе механизмов также имеют были предложены, и имеют то преимущество, что они не требуют стандартной кривой для количественной оценки. Было показано, что такие методы, как MAK2, имеют такие же или лучшие количественные характеристики по сравнению с методами стандартной кривой. Эти основанные на механизмах методы используют знания о процессе амплификации полимеразы для получения оценок исходной концентрации образца. Расширение этого подхода включает точную модель всего профиля реакции ПЦР, которая позволяет использовать данные с высоким соотношением сигнал / шум и возможность проверки качества данных перед анализом.
Согласно исследованиям Ruijter et al. MAK2 предполагает постоянную эффективность амплификации во время реакции ПЦР. Однако теоретический анализ полимеразной цепной реакции, из которой был получен MAK2, показал, что эффективность амплификации не является постоянной во время ПЦР. В то время как количественная оценка MAK2 обеспечивает надежные оценки концентрации целевой ДНК в образце при нормальных условиях кПЦР, MAK2 не дает надежной количественной оценки целевой концентрации для анализов количественной ПЦР с помощью конкурентов.
Существует множество приложений для количественной полимеразной цепной реакции в лаборатории. Он обычно используется как для диагностики, так и для фундаментальных исследований. Применение этого метода в промышленности включает количественную оценку микробной нагрузки в пищевых продуктах или растительных веществах, обнаружение ГМО (Генетически модифицированные организмы ), а также количественную оценку и генотипирование вирусных патогенов человека.
Количественная оценка экспрессии гена традиционными методами обнаружения ДНК ненадежна. Обнаружение мРНК на нозерн-блоте или продуктов ПЦР на геле или саузерн-блоте не позволяет проводить точную количественную оценку. Например, в течение 20–40 циклов типичной ПЦР количество продукта ДНК достигает плато, которое напрямую не коррелирует с количеством целевой ДНК в начальной ПЦР.
ПЦР в реальном времени может использоваться для количественного определения нуклеиновых кислот двумя общими методами: относительным количественным определением и абсолютным количественным определением. Абсолютное количественное определение дает точное количество молекул-мишеней ДНК по сравнению со стандартами ДНК с использованием калибровочной кривой . Поэтому важно, чтобы ПЦР образца и стандарта имели одинаковую эффективность амплификации. Относительная количественная оценка основана на внутренних эталонных генах для определения кратных различий в экспрессии целевого гена. Количественная оценка выражается как изменение уровней экспрессии мРНК, интерпретируемой как комплементарная ДНК (кДНК, генерируемая обратной транскрипцией мРНК). Относительную количественную оценку проводить легче, поскольку она не требует калибровочной кривой, поскольку количество исследуемого гена сравнивается с количеством контрольного эталонного гена.
Поскольку единицы, используемые для выражения результатов относительной количественной оценки, не важны, результаты можно сравнивать по ряду различных RTqPCR. Причина использования одного или нескольких генов домашнего хозяйства состоит в том, чтобы исправить неспецифические вариации, такие как различия в количестве и качестве используемой РНК, которые могут повлиять на эффективность обратной транскрипции и, следовательно, на эффективность всего процесса ПЦР. Однако наиболее важным аспектом процесса является то, что эталонный ген должен быть стабильным.
Выбор этих эталонных генов традиционно проводился в молекулярной биологии с использованием качественных или полуколичественных исследований. такие как визуальный осмотр гелей РНК, нозерн-блот денситометрия или полуколичественная ПЦР (имитация ПЦР). Теперь, в эпоху генома, можно выполнить более подробную оценку для многих организмов с помощью транскриптомных технологий. Однако исследования показали, что амплификация большинства эталонных генов, используемых для количественной оценки экспрессии мРНК, варьируется в зависимости от условий эксперимента. Поэтому необходимо провести начальное статистически методологическое исследование, чтобы выбрать наиболее подходящий эталонный ген.
Был разработан ряд статистических алгоритмов, которые могут определять, какой ген или гены наиболее подходят для использования в данных условиях. Такие, как geNORM или BestKeeper, могут сравнивать пары или средние геометрические для матрицы различных эталонных генов и тканей.
Качественная диагностическая ПЦР применяется для быстрого обнаружения нуклеиновые кислоты, предназначенные для диагностики, например, инфекционных заболеваний, рака и генетических аномалий. Внедрение качественных ПЦР-анализов в лабораторию клинической микробиологии значительно улучшило диагностику инфекционных заболеваний и используется в качестве инструмента для выявления вновь возникающих заболеваний, таких как новые штаммы гриппа и коронавирус в диагностических тестах.
Количественная ПЦР также используется микробиологами, работающими в области безопасности пищевых продуктов, порчи и ферментации пищевых продуктов, а также микробного риска. оценка качества воды (питьевая и рекреационная вода) и в сфере охраны общественного здоровья.
КПЦР также может использоваться для амплификации таксономических или функциональных маркеров генов в ДНК, взятых из образцов окружающей среды. Маркеры представлены генетическими фрагментами ДНК или комплементарной ДНК. Путем амплификации определенного мягкого элемента можно количественно определить количество этого элемента в образце до амплификации. Использование таксономических маркеров (рибосомных генов) и количественной ПЦР может помочь определить количество микроорганизмов в образце и определить различные семейства, роды или виды на основе специфичности маркера. Использование функциональных маркеров (генов, кодирующих белок) может показать экспрессию генов в сообществе, что может раскрыть информацию об окружающей среде.
Сельскохозяйственная промышленность постоянно стремится производить ростки растений или саженцы, свободные от патогенов, чтобы предотвратить экономические потери и сохранить здоровье. Были разработаны системы, позволяющие обнаруживать небольшие количества ДНК Phytophthora ramorum, оомицета, убивающего Oaks и другие виды, смешанные с ДНК растения-хозяина. Различение ДНК патогена и растения основано на амплификации ITS-последовательностей, спейсеров, расположенных в кодирующей области гена рибосомной РНК, которые характерны для каждого таксона. Полевые версии этого метода также были разработаны для идентификации того же патогена.
КПЦР с использованием обратной транскрипции (ОТ-КПЦР) может использоваться для обнаружения ГМО с учетом его чувствительности и динамического диапазона при обнаружении ДНК. Альтернативы, такие как анализ ДНК или белка, обычно менее чувствительны. Используются специфические праймеры, которые амплифицируют не трансген, а промотор , терминатор или даже промежуточные последовательности, используемые в процессе конструирования вектора. Поскольку процесс создания трансгенного растения обычно приводит к встраиванию более чем одной копии трансгена, его количество также обычно оценивается. Это часто выполняется путем относительной количественной оценки с использованием контрольного гена от обработанных видов, который присутствует только в виде единственной копии.
Вирусы могут присутствовать у людей из-за прямого инфекция или сопутствующие инфекции, которые затрудняют диагностику с использованием классических методов и могут привести к неверному прогнозу и лечению. Использование qPCR позволяет как количественную оценку, так и генотипирование (характеристику штамма, выполняемую с использованием кривых плавления) вируса, такого как вирус гепатита B. Степень инфицирования, определяемая количеством копий вирусного генома на единицу ткани пациента, во многих случаях имеет значение; например, вероятность того, что вирус простого герпеса типа 1 реактивируется, связана с количеством инфицированных нейронов в ганглиях. Эта количественная оценка проводится либо с обратной транскрипцией, либо без нее, как это происходит, если вирус интегрируется в геном человека в любой момент его цикла, например, в случае HPV (вирус папилломы человека), где некоторые из его вариантов связаны с появлением рака шейки матки.
