Войти
Схематическое изображение плазмиды pBR322, одной из первых плазмид, широко используемых в качестве вектора клонирования. A вектор клонирования представляет собой небольшой фрагмент ДНК, который может стабильно сохраняться в организме, и в который можно вставить фрагмент чужеродной ДНК для целей клонирования. Вектор клонирования может быть ДНК, взятой из вируса, клетки высшего организма, или это может быть плазмида бактерии. Таким образом, вектор содержит функции, которые позволяют удобно вставлять или удалять фрагмент ДНК в вектор или из него, например, обрабатывая вектор и чужеродную ДНК рестрикционным ферментом , который разрезает ДНК. Полученные таким образом фрагменты ДНК содержат либо тупые концы, либо выступы, известные как липкие концы, а затем векторная ДНК и чужеродная ДНК с совместимыми концами могут быть затем соединены вместе посредством молекулярного лигирования. После того, как фрагмент ДНК был клонирован в вектор клонирования, его можно дополнительно субклонировать в другой вектор, предназначенный для более специфического использования.
Существует много типов клонирующих векторов, но наиболее часто используемые из них - это генно-инженерные плазмиды. Клонирование обычно сначала выполняется с использованием Escherichia coli, а векторы клонирования в E. coli включают плазмиды, бактериофаги (такие как фаг λ ), космиды и бактериальные искусственные хромосомы (BACs). Однако некоторая ДНК не может стабильно сохраняться в E. coli, например, очень большие фрагменты ДНК, и могут использоваться другие организмы, такие как дрожжи. Клонирующие векторы в дрожжах включают искусственные хромосомы дрожжей (YAC).
Все обычно используемые векторы клонирования в молекулярной биологии имеют ключевые особенности, необходимые для их функции, такие как подходящий сайт клонирования и возможность выбора маркер. Другие могут иметь дополнительные функции, специфичные для их использования. Для простоты и удобства клонирование часто выполняется с использованием E. coli. Таким образом, используемые клонирующие векторы часто имеют элементы, необходимые для их размножения и поддержания в E. coli, такие как функциональная точка начала репликации (ori). Ориджин репликации ColE1 обнаружен во многих плазмидах. Некоторые векторы также включают элементы, которые позволяют им сохраняться в другом организме в дополнение к E. coli, и эти векторы называются челночным вектором.
Все векторы клонирования имеют функции, которые позволяют ген, который будет удобно вставлять в вектор или удалять из него. Это может быть сайт множественного клонирования (MCS) или полилинкер, который содержит множество уникальных сайтов рестрикции. Сайты рестрикции в MCS сначала расщепляются рестрикционными ферментами, затем PCR -амплифицированный ген-мишень, также расщепленный теми же ферментами, лигируют в векторы с использованием ДНК-лигазы. При желании последовательность ДНК-мишени может быть вставлена в вектор в определенном направлении. Сайты рестрикции могут быть дополнительно использованы для субклонирования в другой вектор, если это необходимо.
Другие векторы клонирования могут использовать топоизомеразу вместо лигазы, и клонирование может быть выполнено больше быстро без необходимости рестрикционного переваривания вектора или вставки. В этом методе клонирования TOPO линеаризованный вектор активируется путем присоединения топоизомеразы I к его концам, и этот «TOPO-активированный» вектор может затем принимать продукт ПЦР путем лигирования обоих 5'-концов продукта ПЦР, высвобождая топоизомеразу и образуя круговой вектор в процессе. Другой метод клонирования без использования переваривания ДНК и лигазы - это рекомбинация ДНК, например, как используется в системе клонирования шлюза. Ген, однажды клонированный в клонирующий вектор (называемый в этом методе входным клоном), может быть удобно введен в различные векторы экспрессии путем рекомбинации.
A селективный маркер переносится вектор, позволяющий выбрать положительно преобразованные клетки. Устойчивость к антибиотику часто используется в качестве маркера, например, ген бета-лактамазы, который придает устойчивость к пенициллину группе бета-лактамных антибиотиков. как ампициллин. Некоторые векторы содержат два селектируемых маркера, например плазмида pACYC177 имеет ген устойчивости как к ампициллину, так и к канамицину. Челночный вектор, который разработан для поддержания в двух разных организмах, может также потребовать двух селектируемых маркеров, хотя некоторые селектируемые маркеры, такие как устойчивость к зеоцину и гигромицину B, эффективны в разных типах клеток. Ауксотрофные маркеры селекции, которые позволяют ауксотрофным организмам расти в минимальной питательной среде, также могут быть использованы; их примерами являются LEU2 и URA3, которые используются с соответствующими ауксотрофными штаммами дрожжей.
Другой вид селектируемого маркера позволяет проводить положительный отбор плазмиды с клонированным ген. Это может включать использование гена, летального для клеток-хозяев, такого как барназа, Ccda и токсины parD / parE. Обычно это работает путем разрушения или удаления летального гена во время процесса клонирования, и неудачные клоны, в которых летальный ген все еще остается нетронутым, убивают клетки-хозяева, поэтому отбираются только успешные клоны.
Репортерные гены используются в некоторых векторах клонирования для облегчения скрининга успешных клонов за счет использования свойств этих генов, которые позволяют легко идентифицировать успешный клон. Такими признаками, присутствующими в клонирующих векторах, могут быть lacZα-фрагмент для α-комплементации в сине-белый отбор и / или маркерный ген или репортерные гены в рамке с MCS и фланкирует его для облегчения продукции слитых белков. Примерами партнеров слияния, которые могут использоваться для скрининга, являются зеленый флуоресцентный белок (GFP) и люцифераза.
Вектор клонирования не обязательно должен содержать подходящие элементы для экспрессия клонированного целевого гена, такого как промотор и сайт связывания рибосомы (RBS), однако многие из них делают это и могут затем работать как вектор выражения. Целевая ДНК может быть вставлена в сайт, который находится под контролем конкретного промотора, необходимого для экспрессии целевого гена в выбранном хозяине. Если промотор присутствует, экспрессия гена предпочтительно строго контролируется и индуцируется, так что белки продуцируются только при необходимости. Некоторыми обычно используемыми промоторами являются промоторы T7 и lac. Присутствие промотора необходимо при использовании таких методов скрининга, как сине-белый отбор.
Клонирующие векторы без промотора и RBS для клонированной последовательности ДНК иногда используются, например, при клонировании генов, продукты которых токсичны для E. coli клеток. Промотор и RBS для клонированной последовательности ДНК также не нужны при первом создании геномной или библиотеки кДНК клонов, поскольку клонированные гены обычно субклонируются в более подходящий вектор экспрессии, если их экспрессия требуется.
Некоторые векторы предназначены только для транскрипции без экспрессии гетерологичного белка, например для продукции мРНК in vitro. Эти векторы называются векторами транскрипции. В них могут отсутствовать последовательности, необходимые для полиаденилирования и терминации, поэтому их нельзя использовать для продукции белка.
Доступно большое количество векторов клонирования, и выбор вектора может зависеть от ряда факторов, таких как размер вставки, количество копий и метод клонирования. Большая вставка может нестабильно сохраняться в общем векторе клонирования, особенно для тех, которые имеют большое количество копий, поэтому для клонирования больших фрагментов может потребоваться более специализированный вектор клонирования.
Плазмида pUC имеет высокое количество копий, содержит сайт множественного клонирования (полилинкер), ген для отбора антибиотиков ампициллина, и может использоваться для сине-белого экрана. Плазмиды автономно реплицируют кольцевую внехромосомную ДНК. Это стандартные и наиболее часто используемые векторы клонирования. Большинство обычных плазмид можно использовать для клонирования вставки ДНК размером до 15 т.п.н. Одним из наиболее ранних широко используемых векторов клонирования является плазмида pBR322. Другие векторы клонирования включают серию плазмид pUC, и доступно большое количество различных плазмидных векторов клонирования. Многие плазмиды имеют высокое число копий, например pUC19, который имеет число копий 500-700 копий на клетку, и высокое число копий полезно, поскольку оно дает больший выход рекомбинантной плазмиды для последующих манипуляций. Однако плазмиды с низким числом копий могут предпочтительно использоваться в определенных обстоятельствах, например, когда белок из клонированного гена токсичен для клеток.
Некоторые плазмиды содержат происхождение бактериофага M13 репликации и может быть использован для создания одноцепочечной ДНК. Они называются фагмидой, и их примерами являются серии клонирующих векторов.
Бактериофагами, используемыми для клонирования, являются фаг λ и фаг M13. Существует верхний предел количества ДНК, которое может быть упаковано в фаг (максимум 53 т.п.н.), поэтому, чтобы позволить встраивать чужеродную ДНК в ДНК фага, в векторах для клонирования фага может потребоваться удаление некоторых несущественных генов., например гены для лизогении, поскольку использование фага λ в качестве вектора клонирования включает только литический цикл. Есть два типа λ-фаговых векторов - вектор вставки и вектор замены. Инсерционные векторы содержат уникальный сайт расщепления, в который может быть вставлена чужеродная ДНК размером 5–11 т.п.н. В замещающих векторах сайты расщепления фланкируют область, содержащую гены, не существенные для литического цикла, и эта область может быть удалена и заменена вставкой ДНК в процессе клонирования, а также может быть вставлена ДНК большего размера размером 8–24 т.п.н.
Существует также более низкий предел размера ДНК, которая может быть упакована в фаг, а векторная ДНК, которая слишком мала, не может быть должным образом упакована в фаг. Это свойство можно использовать для отбора - вектор без вставки может быть слишком маленьким, поэтому для размножения можно выбрать только векторы со вставкой.
Космиды - это плазмиды, которые включают сегмент бактериофага λ ДНК, которая имеет когезионный концевой участок (cos), который содержит элементы, необходимые для упаковки ДНК в λ-частицы. Обычно он используется для клонирования больших фрагментов ДНК размером от 28 до 45 килобайт.
Вставка размером до 350 килобайт может быть клонирована в бактериальной искусственной хромосоме (BAC). BAC поддерживаются в E. coli с числом копий только 1 на клетку. ВАС основаны на плазмиде F, другая искусственная хромосома, называемая PAC, основана на фаге P1.
искусственная хромосома дрожжей используются в качестве векторов для клонирования фрагментов ДНК размером более 1 мега оснований (1 МБ = 1000 КБ). Они полезны для клонирования более крупных фрагментов ДНК, необходимых для картирования геномов, например, в проекте генома человека. Он содержит теломерную последовательность, автономно реплицирующуюся последовательность (функции, необходимые для репликации линейных хромосом в дрожжевых клетках). Эти векторы также содержат подходящие сайты рестрикции для клонирования чужеродной ДНК, а также гены, которые будут использоваться в качестве селективных маркеров.
Искусственная хромосома человека может быть потенциально полезной в качестве векторов для переноса генов для доставки генов в клетки человека, а также инструмента для исследований экспрессии и определения функции хромосомы человека. Он может нести очень большой фрагмент ДНК (для практических целей нет верхнего предела размера), поэтому он не имеет проблемы ограниченной способности клонирования других векторов, а также позволяет избежать возможного инсерционного мутагенеза, вызванного интеграцией в хромосомы хозяина вирусами.
Вирусные векторы животных и растений Вирусы, которые инфицируют клетки растений и животных, также подвергались манипуляции для введения чужеродных генов в клетки растений и животных. Естественная способность вирусов адсорбироваться в клетки, вводить свою ДНК и реплицироваться сделала их идеальными носителями для переноса чужеродной ДНК в эукариотические клетки в культуре. Вектор на основе вируса обезьяны 40 (SV40) был использован в первом эксперименте по клонированию с участием клеток млекопитающих. Ряд векторов, основанных на других типах вирусов, таких как аденовирусы и вирус папилломы, был использован для клонирования генов у млекопитающих. В настоящее время популярны ретровирусные векторы для клонирования генов в клетки млекопитающих. В случае таких растений, как вирус мозаики цветной капусты, вирус мозаики табака и вирусы Близнецов, были использованы с ограниченным успехом.
Чашка с агаром LB, показывающая результат сине-белого экрана. Белые колонии могут содержать вставку в несущую плазмиду, а синие - неудачные клоны. Многие векторы общего назначения, такие как pUC19 обычно включают систему для обнаружения присутствия клонированного фрагмента ДНК на основе потери легко оцениваемого фенотипа. Наиболее широко используется ген, кодирующий E. coli β-галактозидазу, активность которого можно легко определить по способности кодируемого им фермента гидролизовать растворимый бесцветный субстрат X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-d-галактозид) в нерастворимый голубой продукт (5,5'-дибром-4,4'-дихлориндиго). Клонирование фрагмента ДНК в векторной последовательности lacZα β-галактозидазы предотвращает выработку активного фермента. Если X-gal включена в чашки с селективным агаром, колонии трансформантов обычно имеют синий цвет в случае вектора без вставленной ДНК и белый цвет в случае вектора, содержащего фрагмент клонированной ДНК.
