Войти
| Семейство бактериальных люциферазных монооксигеназ | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||||||||||
| Условное обозначение | Bac_luciferase | ||||||||||
| Pfam | PF00296 | ||||||||||
| ИнтерПро | IPR016048 | ||||||||||
| ПРОФИЛЬ | PDOC00397 | ||||||||||
| SCOP2 | 1nfp / SCOPe / SUPFAM | ||||||||||
| |||||||||||
| Каталитический домен динофлагеллят люциферазы | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 кристаллическая структура люциферазного домена динофлагелляты Lingulodinium polyedrum | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Условное обозначение | Люцифераза_ кошка | ||||||||
| Pfam | PF10285 | ||||||||
| ИнтерПро | IPR018804 | ||||||||
| |||||||||
| N-концевой домен динофлагеллат люциферазы / LBP | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||||||||
| Условное обозначение | Люцифераза_N | ||||||||
| Pfam | PF05295 | ||||||||
| ИнтерПро | IPR007959 | ||||||||
| |||||||||
| Домен спирального пучка динофлагеллят люциферазы | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||||||||
| Условное обозначение | Люцифераза_3H | ||||||||
| Pfam | PF10284 | ||||||||
| ИнтерПро | IPR018475 | ||||||||
| |||||||||
Люцифераза - это общий термин для класса окислительных ферментов, производящих биолюминесценцию, и обычно отличается от фотобелка. Название было впервые использовано Рафаэлем Дюбуа, который изобрел слова люциферин и люцифераза для обозначения фермента и соответственно. Оба слова происходят от латинского слова lucifer, означающего «носитель света», которое, в свою очередь, происходит от латинских слов «свет» ( люкс) и «приносить или нести» ( ферре).
| Люцифераза светлячка | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Структура люциферазы светлячков Photinus pyralis. | |||||||
| Идентификаторы | |||||||
| Организм | Photinus pyralis | ||||||
| Условное обозначение | Люцифераза светлячка | ||||||
| PDB | 1LCI Больше структур | ||||||
| UniProt | P08659 | ||||||
| Прочие данные | |||||||
| Номер ЕС | 1.13.12.7 | ||||||
| |||||||
Люциферазы широко используются в биотехнологии, в микроскопии и в качестве репортерных генов для многих из тех же приложений, что и флуоресцентные белки. Однако, в отличие от флуоресцентных белков, люциферазы не требуют внешнего источника света, но требуют добавления люциферина, потребляемого субстрата.
Множество организмов регулируют свое световое производство, используя разные люциферазы в различных светоизлучающих реакциях. Большинство изученных люцифераз было обнаружено у животных, включая светлячков, и многих морских животных, таких как веслоногие рачки, медузы и морские анютины глазки. Однако люциферазы изучались на светящихся грибах, таких как гриб Джек-О-Фонарь, а также на примерах в других царствах, включая светящиеся бактерии и динофлагеллаты.
В люциферазах светлячков - которых насчитывается более 2000 видов - и других элатероидного (щелкуны и родственники в целом) разнообразно достаточно, чтобы быть полезными в молекулярной филогении. У светлячков необходимый кислород поступает через трубку в брюшной полости, называемую брюшной трахеей. Одна хорошо изученная люцифераза - это люцифераза светлячка Photinini Photinus pyralis, оптимальная pH которой составляет 7,8.
Также хорошо изученным является морская фиалка, Renilla reniformis. В этом организме люцифераза ( ренилла-люциферин-2-монооксигеназа ) тесно связана с люциферин-связывающим белком, а также с зеленым флуоресцентным белком ( GFP ). Триггера кальция релиз люциферина ( Коэлентеразин ) от связывающего белка люциферина. Затем субстрат доступен для окисления люциферазой, где он разлагается до целентерамида с выделением энергии. В отсутствие GFP эта энергия будет выделяться в виде фотона синего света (пиковая длина волны излучения 482 нм). Тем не менее, из - за тесно связаны GFP, энергия, выделяемая люциферазы вместо этого соединен через резонансный перенос энергии к флуорофора в GFP, а затем выделяется в виде фотона зеленого света (длина волны пика эмиссии 510 нм). Катализируемая реакция:
Недавно были идентифицированы новые люциферазы, которые, в отличие от других люцифераз, представляют собой молекулы, секретируемые естественным путем. Одним из таких примеров являются Metridia коэлентеразина -зависимой люциферазой (MetLuc, A0A1L6CBM1 ), который является производной от морского копепода Metridia Лонга. Ген люциферазы, секретируемый Metridia longa, кодирует белок 24 кДа, содержащий N-концевой секреторный сигнальный пептид из 17 аминокислотных остатков. Чувствительность и высокая интенсивность сигнала этой молекулы люциферазы оказались полезными во многих репортерных исследованиях. Некоторые из преимуществ использования секретируемой репортерной молекулы, такой как MetLuc, - это ее протокол без лизиса, который позволяет проводить анализы живых клеток и несколько анализов на одной и той же клетке.
Биолюминесценция бактерий наблюдается у видов Photobacterium, Vibrio fischeri, Vibrio haweyi и Vibrio harveyi. Излучение света у некоторых биолюминесцентных бактерий использует «антенну», такую как белок люмазин, для принятия энергии из первичного возбужденного состояния люциферазы, в результате чего возникает возбужденный хромофор лульназина, который излучает свет с более короткой длиной волны (более синий), в то время как у других используйте желтый флуоресцентный белок (YFP) с FMN в качестве хромофора и излучающий свет с красным смещением по сравнению с люциферазой.
Динофлагеллят люциферазы является мульти- домен эукариот белок, состоящий из N-концевой домен, и три каталитических доменов, каждый из которых предшествует спирального домена расслоения. Структура из фитопланктона динофлагеллатой люциферазы каталитического домена была решена. Ядро домена представляет собой бета-бочонок из 10 цепей, который структурно подобен липокалинам и FABP. N-концевой домен является консервативным между динофлагеллат люциферазой и люциферин- связывающими белками (LBP). Было высказано предположение, что эта область может опосредовать взаимодействие между LBP и люциферазой или их ассоциацию с вакуолярной мембраной. Домен спирального пучка имеет трехспиральную структуру пучка, которая содержит четыре важных гистидина, которые, как считается, играют роль в регуляции pH фермента. В β-стволе динофлагеллат люциферазы при pH 8 имеется большой карман для размещения тетрапиррольного субстрата, но нет отверстия, позволяющего субстрату проникать. Следовательно, должно произойти значительное конформационное изменение, чтобы обеспечить доступ и пространство для лиганда в активном сайте, и источником этого изменения являются четыре N-концевых остатка гистидина. При pH 8 можно видеть, что непротонированные остатки гистидина участвуют в сети водородных связей на границе спиралей в пучке, которые блокируют доступ субстрата к активному центру и разрушение этого взаимодействия протонированием (при pH 6,3) или путем замены остатков гистидина на аланин вызывает большое молекулярное движение пучка, разделяя спирали на 11 Å и открывая каталитический сайт. По логике, остатки гистидина не могут быть заменены аланином в природе, но эта экспериментальная замена дополнительно подтверждает, что более крупные остатки гистидина блокируют активный сайт. Кроме того, три последовательности Gly-Gly, одна в N-концевой спирали и две в мотиве спираль-петля-спираль, могут служить шарнирами, вокруг которых вращаются цепи, чтобы еще больше открыть путь к каталитическому сайту и увеличить активную сайт.
Люцифераза динофлагеллят способна излучать свет из-за своего взаимодействия со своим субстратом ( люциферином ) и люциферин-связывающим белком (LBP) в сцинтиллонной органелле, обнаруженной в динофлагеллатах. Люцифераза действует в соответствии с люциферином и LBP, чтобы излучать свет, но каждый компонент функционирует при разном pH. Люцифераза и ее домены не активны при pH 8, но они чрезвычайно активны при оптимальном pH 6,3, тогда как LBP связывает люциферин при pH 8 и высвобождает его при pH 6,3. Следовательно, люциферин высвобождается для реакции с активной люциферазой только тогда, когда сцинтиллон подкисляется до pH 6,3. Следовательно, для снижения pH открываются управляемые по напряжению каналы в сцинтиллонной мембране, позволяя проникать протонам из вакуоли, обладающей потенциалом действия, возникающим в результате механической стимуляции. Следовательно, можно видеть, что потенциал действия в вакуолярной мембране приводит к подкислению, и это, в свою очередь, позволяет высвободить люциферин для реакции с люциферазой в сцинтилоне, производя вспышку синего света.
Все люциферазы классифицируются как оксидоредуктазы ( EC 1.13.12.- ), что означает, что они действуют на отдельных доноров с включением молекулярного кислорода. Поскольку люциферазы принадлежат ко многим различным семействам белков, которые не связаны между собой, не существует объединяющего механизма, поскольку любой механизм зависит от комбинации люциферазы и люциферина. Однако все охарактеризованные на сегодняшний день реакции люцифераза-люциферин на какой-то стадии требуют молекулярного кислорода.
Реакция, катализируемая бактериальной люциферазой, также является окислительным процессом:
В реакции молекулярный кислород окисляет флавинмононуклеотид и длинноцепочечный алифатический альдегид до алифатической карбоновой кислоты. В результате реакции образуется возбужденный промежуточный гидроксифлавин, который дегидратируется до продукта FMN с излучением сине-зеленого света.
Почти вся энергия, вкладываемая в реакцию, превращается в свет. Эффективность реакции составляет от 80% до 90%. Для сравнения, лампа накаливания преобразует только около 10% своей энергии в свет, а светодиод 150 люмен на ватт (лм / Вт) преобразует 20% входной энергии в видимый свет.
Люциферазы можно производить в лаборатории с помощью генной инженерии для ряда целей. Гены люциферазы можно синтезировать и внедрять в организмы или трансфицировать в клетки. По состоянию на 2002 год мыши, тутовые шелкопряды и картофель - это лишь некоторые из организмов, которые уже были созданы для производства белка.
В реакции люциферазы свет испускается, когда люцифераза действует на соответствующий субстрат люциферина. Эмиссия фотонов может быть обнаружена с помощью светочувствительных приборов, таких как люминометр или модифицированные оптические микроскопы. Это позволяет наблюдать за биологическими процессами. Поскольку для биолюминесценции люциферазы не требуется световое возбуждение, имеется минимальная автофлуоресценция и, следовательно, флуоресценция практически без фона. Таким образом, даже 0,02 пг можно точно измерить с помощью стандартного сцинтилляционного счетчика.
В биологических исследованиях люцифераза обычно используется в качестве репортера для оценки транскрипционной активности в клетках, трансфицированных генетической конструкцией, содержащей ген люциферазы, под контролем интересующего промотора. Кроме того, пролуминесцентные молекулы, которые превращаются в люциферин при активности определенного фермента, можно использовать для обнаружения активности фермента в связанных или двухэтапных анализах люциферазы. Такие субстраты использовались, среди прочего, для обнаружения активности каспазы и активности цитохрома Р450.
Люциферазу также можно использовать для определения уровня клеточного АТФ в анализах жизнеспособности клеток или в анализах активности киназы. Люцифераза может действовать как белок-сенсор АТФ посредством биотинилирования. Биотинилирование будет иммобилизации люциферазы на клеточной поверхности путем связывания с стрептавидин - биотин комплекс. Это позволяет люциферазе обнаруживать выход АТФ из клетки и эффективно отображать высвобождение АТФ в реальном времени посредством биолюминесценции. Люциферазу можно дополнительно сделать более чувствительной для обнаружения АТФ за счет увеличения интенсивности люминесценции путем изменения определенных аминокислотных остатков в последовательности белка.
Визуализация всего животного (называемая in vivo при жизни или, иначе, называемая визуализацией ex vivo) - мощный метод изучения популяций клеток у живых животных, таких как мыши. Различные типы клеток (например, стволовые клетки костного мозга, Т-клетки) могут быть сконструированы для экспрессии люциферазы, что позволяет неинвазивно визуализировать их внутри живого животного с помощью чувствительной камеры устройства с зарядовой парой ( камеры CCD ). проследить онкогенез и реакцию опухолей на лечение на животных моделях. Однако факторы окружающей среды и терапевтические вмешательства могут вызывать некоторые расхождения между опухолевой нагрузкой и интенсивностью биолюминесценции в отношении изменений пролиферативной активности. Интенсивность сигнала, измеренного с помощью визуализации in vivo, может зависеть от различных факторов, таких как абсорбция D-люциферина брюшиной, кровоток, проницаемость клеточной мембраны, наличие кофакторов, внутриклеточный pH и прозрачность вышележащих тканей, а также количество люциферазы.
Люцифераза - это термочувствительный белок, который используется в исследованиях денатурации белков для проверки защитных свойств белков теплового шока. Возможности использования люциферазы продолжают расширяться.
СМИ, связанные с люциферазой, на Викискладе?
Биологический портал 