Войти
A библиотека кДНК представляет собой комбинацию клонированных фрагментов кДНК (комплементарной ДНК ), вставленных в коллекцию клеток-хозяев, которые составляют некоторую часть транскриптома организма и хранятся как «библиотека ». кДНК образуется из полностью транскрибированной мРНК, обнаруженной в ядре, и поэтому содержит только экспрессированные гены организма. Аналогичным образом могут быть получены тканеспецифичные библиотеки кДНК. В эукариотических клетках зрелая мРНК уже сплайсирована, следовательно, полученная кДНК не имеет интронов и может легко экспрессироваться в бактериальной клетке. Хотя информация в библиотеках кДНК является мощным и полезным инструментом, поскольку продукты генов легко идентифицируются, в библиотеках отсутствует информация о энхансерах, интронах и других регуляторных элементах, обнаруженных в геномной Библиотека ДНК.
Создание библиотеки кДНК. кДНК создается из зрелой мРНК из эукариотическая клетка с использованием обратной транскриптазы. У эукариот поли- (A) хвост (состоящий из длинной последовательности нуклеотидов аденина) отличает мРНК от тРНК и рРНК и поэтому его можно использовать в качестве сайта праймера для обратной транскрипции. Проблема заключается в том, что не все транскрипты, например, для гистона, кодируют хвост поли-A.
Во-первых, мРНК получают и очищают от остальных РНК. Существует несколько методов очистки РНК, таких как экстракция тризолом и очистка на колонке. Очистку колонки проводят с использованием смол, покрытых олигомерными нуклеотидами dT, где будет связываться только мРНК, имеющая поли-А-хвост. Остальные РНК элюируются. МРНК элюируют с использованием буфера для элюирования и некоторого нагрева для отделения цепей мРНК от олиго-dT.
После очистки мРНК олиго-dT (короткая последовательность дезокситимидиновых нуклеотидов) маркируется как комплементарный праймер, который связывается с поли-A-хвостом, обеспечивая свободный 3 '-OH конец, который может быть удлинен обратной транскриптазой для создания комплементарной цепи ДНК. Теперь мРНК удаляют с помощью фермента РНКазы, оставляя одноцепочечную кДНК (оскДНК). Эта оскДНК превращается в двухцепочечную ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Однако для ДНК-полимеразы для синтеза комплементарной цепи необходим свободный 3'-ОН-конец. Это обеспечивается самой оскДНК путем создания петли шпильки на 3'-конце путем наматывания на себя. Полимераза удлиняет 3'-ОН конец, и позже петля на 3'-конце открывается под действием ножниц S1нуклеазы. Эндонуклеазы рестрикции и ДНК-лигаза затем используются для клонирования последовательностей в бактериальные плазмиды.
Затем отбирают клонированные бактерии, обычно с использованием выбора антибиотиков. После выбора создаются запасы бактерий, которые впоследствии можно выращивать и секвенировать для составления библиотеки кДНК.
Библиотеки кДНК обычно используются при воспроизведении геномов эукариот, так как объем информации сокращается для удаления большого количества некодирующих областей из библиотеки. Библиотеки кДНК используются для экспрессии эукариотических генов в прокариотах. Прокариоты не имеют интронов в своей ДНК и, следовательно, не обладают какими-либо ферментами, которые могли бы вырезать ее в процессе транскрипции. кДНК не имеет интронов и поэтому может экспрессироваться в прокариотических клетках. Библиотеки кДНК наиболее полезны в обратной генетике, где дополнительная геномная информация менее полезна. Кроме того, библиотеки кДНК часто используются в функциональном клонировании для идентификации генов на основе функции кодируемого белка. При изучении эукариотической ДНК библиотеки экспрессии конструируются с использованием комплементарной ДНК (кДНК), чтобы гарантировать, что вставка действительно является геном.
В библиотеке кДНК отсутствует не- кодирующие и регуляторные элементы, обнаруженные в геномной ДНК. Библиотеки геномной ДНК предоставляют более подробную информацию об организме, но их создание и хранение требуют больших ресурсов.
Молекулы кДНК можно клонировать с использованием линкеров сайтов рестрикции. Линкеры представляют собой короткие двухцепочечные фрагменты ДНК (олигодезоксирибонуклеотид ) длиной примерно от 8 до 12 пар нуклеотидов, которые включают сайт расщепления эндонуклеазой рестрикции, например BamHI. Как кДНК, так и линкер имеют тупые концы, которые можно лигировать вместе с использованием высокой концентрации ДНК-лигазы Т4. Затем в молекуле кДНК образуются липкие концы путем расщепления концов кДНК (которые теперь имеют линкеры со встроенным сайтом) соответствующей эндонуклеазой. Затем клонирующий вектор (плазмида ) также расщепляют соответствующей эндонуклеазой. После лигирования вставки «липкий конец » в вектор полученная молекула рекомбинантной ДНК переносится в E. coli для клонирования.
