Войти
A космида - это тип гибридной плазмиды, которая содержит последовательность cos лямбда-фага. Последовательности ДНК космид (сайты cos + плазмида = космиды) происходят от фага лямбда. Они часто используются в качестве вектора клонирования в генной инженерии. Космиды можно использовать для создания геномных библиотек. Впервые они были описаны Коллинзом и Хоном в 1978 году. Космиды могут содержать от 37 до 52 (обычно 45) kb ДНК, пределы основаны на нормальном размере упаковки бактериофага. Они могут реплицироваться как плазмиды, если у них есть подходящий источник репликации (ori): например, SV40 ori в клетках млекопитающих, ColE1 ori для репликации двухцепочечной ДНК или f1 ori для репликации одноцепочечной ДНК в прокариотах. Они часто также содержат ген для отбора, такой как устойчивость к антибиотикам, так что трансформированные клетки можно идентифицировать, высевая на среду, содержащую антибиотик. Те клетки, которые не захватили космиду, не смогут расти.
В отличие от плазмид, они также могут быть упакованы in vitro в фаг капсиды, шаг, который требует наличия липких концов, также известных как сайты cos, которые также используются при клонировании с фагом лямбда в качестве вектора, однако почти все гены лямбда были удалены, за исключением последовательности cos. Затем гибридная космидная ДНК в капсидах может быть перенесена в бактериальные клетки посредством трансдукции. Поскольку существует потребность в упаковке in vitro, при которой требуется по крайней мере 38 т.п.н. ДНК между сайтами cos, вектор без ДНК вставки не будет упакован (нестабильность плазмид увеличивается, если новая вставленная ДНК содержит много прямых повторов или палиндромных (инвертированных) повторов) ДНК. Этой нестабильности можно в значительной степени противодействовать, используя бактерию-хозяин со специфическими мутациями, влияющими на рекомбинацию ДНК (NB Отсутствие инвертированных повторов было отмечено в первой публикации Hohn Collins, процитированной выше; см. также).
Последовательности Cos имеют длину ~ 200 пар оснований и необходимы для упаковки. Они содержат сайт cosN, где ДНК разрывается на каждой нити на расстоянии 12 п.н. друг от друга. Это вызывает линеаризацию круговой космиды с двумя «связными» или «липкими концами» по 12 п.н. (ДНК должна быть линейной относительно в головку фага.) Сайт cosB содержит e terminase, пока он надрезает и разделяет пряди. Сайт cosQ следующей космиды (поскольку репликация по катящемуся кругу часто приводит к линейным конкатемерам ) удерживается терминазой после того, как предыдущая космида была упакована, чтобы предотвратить деградацию клетками ДНКазы.
Схема клонирования ДНК в космидном векторе. Космиды - это преимущественно плазмиды с бактериальным oriV, маркером селекции антибиотика и сайтом клонирования, но они несут один или, совсем недавно, два, cos сайты, полученные из лямбда бактериофага. В зависимости от конкретной цели эксперимента доступны космиды широкого круга хозяев, космиды челноков или космиды "млекопитающих" (связанные с SV40 oriV и маркерами селекции млекопитающих). Грузоподъемность космид варьируется в зависимости от размера самого вектора, но обычно составляет около 40–45 кб. Процедура клонирования включает создание двух векторных ветвей, которые затем присоединяются к чужеродной ДНК. Отбор против космидной ДНК дикого типа просто осуществляется путем исключения размера. Следовательно, космиды всегда образуют колонии, а не бляшки. Кроме того, плотность клонов намного ниже и составляет примерно 10-10 65 КОЕ 2 на мкг лигированной ДНК.
После создания библиотек рекомбинантных лямбда или космид общая ДНК переносится в подходящего хозяина E. coli с помощью метода, называемого упаковкой in vitro. Необходимые упаковочные экстракты получены из лизогенов E. coli cI857 (red-gam-Sam и Dam (головной узел) и Eam (хвостовой узел) соответственно). Эти экстракты будут распознавать и упаковывать рекомбинантные молекулы in vitro, генерируя либо зрелые фаговые частицы (векторы на основе лямбда), либо рекомбинантные плазмиды, содержащиеся в фаговых оболочках (космиды). Эти различия отражаются в различной частоте инфицирования, наблюдаемой в пользу векторов с заменой лямбда. Это компенсирует их немного меньшую грузоподъемность. Библиотеки фагов также легче хранить и проверять, чем библиотеки космид.
Целевая ДНК: геномная ДНК, которая должна быть клонирована, должна быть разрезана на рестрикционные фрагменты соответствующего размера. Обычно это делается путем частичного ограничения с последующим либо фракционированием по размеру, либо дефосфорилированием (с использованием фосфатазы из кишечника теленка), чтобы избежать скремблирования хромосом, то есть лигирования физически несвязанных фрагментов.
Обычно используемые векторы включают "SuperCos 1"
