Войти
Мутагенез с насыщением сайтов - это тип сайт-направленного мутагенеза. На этом изображении показан мутагенез насыщения одного положения теоретического белка с 10 остатками. Версия белка дикого типа показана вверху, где М представляет первую аминокислоту метионин, а * представляет собой окончание трансляции. Все 19 мутантов изолейцина в положении 5 показаны ниже. 
Как библиотеки ДНК генерируются с помощью случайного мутагенеза пространство последовательностей образца. Показана аминокислота, замещенная в данном положении. Каждая точка или набор связанных точек является одним из членов библиотеки. ПЦР, подверженная ошибкам, случайным образом изменяет некоторые остатки на другие аминокислоты. Аланиновое сканирование заменяет каждый остаток белка на аланин, один за другим. Насыщение сайта заменяет каждую из 20 возможных аминокислот (или некоторые из них) в одном положении, одну за другой. В молекулярной биологии, библиотека является набор фрагментов ДНК, которые хранятся и размножаются в популяции микроорганизмов посредством процесса молекулярного клонирования. Существуют различные типы библиотек ДНК, включая библиотеки кДНК (сформированные из РНК с обратной транскрипцией ), геномные библиотеки (сформированные из геномной ДНК) и рандомизированные библиотеки мутантов. (образуется путем синтеза гена de novo, в который включены альтернативные нуклеотиды или кодоны). Технология библиотеки ДНК является основой современной молекулярной биологии, генной инженерии и белковой инженерии, и применение этих библиотек зависит от источника исходной ДНК. фрагменты. Существуют различия в векторах клонирования и методах, используемых при приготовлении библиотеки, но в целом каждый фрагмент ДНК уникальным образом вставляется в вектор клонирования, а затем пул рекомбинантных молекул ДНК переносится в популяцию бактерии (Бактериальная искусственная хромосома или библиотека ВАС) или дрожжи, так что каждый организм содержит в среднем одну конструкцию (вектор + вставка). По мере выращивания популяции организмов в культуре содержащиеся в них молекулы ДНК копируются и размножаются (таким образом, «клонируются»).
Термин «библиотека» может относиться к популяции организмов, каждый из которых несет Молекула ДНК вставлена в вектор клонирования или, альтернативно, в набор всех клонированных векторных молекул.
A библиотека кДНК представляет собой образец мРНК, очищенный из определенного источника (либо коллекции клеток, конкретной ткани, либо всего организма), который был преобразован обратно в матрицу ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы. Таким образом, он представляет гены, которые активно транскрибировались в этом конкретном источнике в физиологических условиях, условиях развития или окружающей среды, которые существовали, когда мРНК была очищена. Библиотеки кДНК могут быть созданы с использованием методов, способствующих «полноразмерным» клонам, или в условиях, которые генерируют более короткие фрагменты, используемые для идентификации «тегов экспрессируемой последовательности ».
Библиотеки кДНК полезны в обратной генетике, но они представляют только очень небольшую (менее 1%) часть общего генома в данном организме.
Применения библиотек кДНК включают:
A геномная библиотека - это набор клонов, которые вместе представляют собой весь геном данного организма. Число клонов, составляющих геномную библиотеку, зависит от (1) размера рассматриваемого генома и (2) размера вставки, допустимого для конкретной системы вектора клонирования. Для большинства практических целей тканевый источник геномной ДНК не важен, потому что каждая клетка тела содержит практически идентичную ДНК (за некоторыми исключениями).
Применение геномных библиотек включает:
Описание одного из распространенных способов клонирования библиотеки сайт-направленного мутагенеза (т. е. с использованием вырожденных олигонуклеотидов). Интересующий ген подвергается ПЦР с олигонуклеотидами, которые содержат область, которая полностью комплементарна матрице (синий) и тот, который отличается от матрицы одним или несколькими нуклеотидами (красный). Многие такие праймеры, содержащие вырожденность в некомплементарной области, объединяются в одну и ту же ПЦР, что приводит к множеству разных продуктов ПЦР с разными мутациями в этой области. (отдельные мутанты показаны ниже разными цветами). В отличие от типа библиотеки Как описано выше, существует множество искусственных методов создания библиотек вариантных генов. Вариации по всему гену могут быть внесены случайным образом с помощью подверженной ошибкам ПЦР, перетасовки ДНК для рекомбинации частей схожих генов вместе или методов на основе транспозонов для введения инделей. Альтернативно, мутации могут быть нацелены на конкретные кодоны во время синтеза de novo или насыщающего мутагенеза для конструирования одного или нескольких точечных мутантов гена контролируемым образом. Это приводит к смеси двухцепочечных молекул ДНК, которые представляют собой варианты исходного гена.
Затем экспрессированные белки из этих библиотек могут быть подвергнуты скринингу на варианты, которые проявляют благоприятные свойства (например, стабильность, сродство связывания или ферментативную активность). Это можно повторять в циклах создания вариантов генов и скрининга продуктов экспрессии в процессе направленной эволюции.
При создании библиотеки мРНК (например, с клонами кДНК) существует несколько возможных протоколов выделения мРНК полной длины. Для извлечения ДНК из библиотек геномной ДНК (также известной как гДНК) может быть полезен мини-препарат ДНК.
Библиотеки кДНК требуют осторожности, чтобы гарантировать, что полноразмерные клоны мРНК захвачены в виде кДНК (которая позже будет вставлена в векторы). По этой причине было разработано несколько протоколов для оптимизации синтеза 1-й цепи кДНК и 2-й цепи кДНК, а также для повышения вероятности направленного клонирования в вектор.
Фрагменты гДНК генерируются из экстрагированной гДНК с использованием неспецифических рестрикционных ферментов с частым резанием.
Представляющие интерес нуклеотидные последовательности сохраняются в виде вставок в плазмиду или геном бактериофага, который использовался для инфицирования бактериального клетки.
Чаще всего векторы размножаются в бактериальных клетках, но при использовании YAC (искусственная хромосома дрожжей) можно использовать дрожжевые клетки. Векторы также могут быть размножены в вирусах, но это может занять много времени и утомительно. Однако высокая эффективность трансфекции, достигаемая с помощью вирусов (часто фагов), делает их полезными для упаковки вектора (с лигированной вставкой) и последующего введения их в бактериальную (или дрожжевую) клетку.
Кроме того, для библиотек кДНК была разработана система, использующая фаг Lambda Zap II, ExAssist и 2 вида E. coli. Вместо этого также можно использовать систему Cre-Lox, использующую сайты loxP и экспрессию фермента рекомбиназы in vivo. Это примеры систем удаления in vivo. Иссечение in vitro включает субклонирование, часто с использованием традиционных рестрикционных ферментов и стратегий клонирования. Иссечение in vitro может занять больше времени и может потребовать большей практической работы, чем системы удаления in vivo. В любом случае системы позволяют перемещать вектор из фага в живую клетку, где вектор может реплицироваться и размножаться до тех пор, пока не будет использована библиотека.
Рабочий процесс для скрининга синтетической библиотеки для идентификации клеток, продуцирующих интересующее химическое вещество. Это включает «скрининг» на интересующие последовательности. Для этого есть несколько возможных способов.
