Войти
Белковая инженерия - это процесс разработки полезных или ценных белков. Это молодая дисциплина, в которой проводится много исследований, направленных на понимание сворачивания белка и признание принципов дизайна белка. Это также рынок продуктов и услуг, оценочная стоимость которого к 2017 году составит 168 миллиардов долларов.
Существуют две общие стратегии белковой инженерии: рациональный дизайн белка и направленная эволюция. Эти методы не исключают друг друга; исследователи часто применяют и то, и другое. В будущем более подробное знание структуры белка и функции, а также успехи в области высокопроизводительного скрининга могут значительно расширить возможности белковой инженерии. В конце концов, даже неприродные аминокислоты могут быть включены с помощью более новых методов, таких как расширенный генетический код, которые позволяют кодировать новые аминокислоты в генетическом коде.
В рациональном дизайне белка ученый использует подробные знания структуры и функции белка для внесения желаемых изменений. В общем, это имеет то преимущество, что оно недорогое и технически простое, поскольку методы сайт-направленного мутагенеза хорошо разработаны. Однако его главный недостаток заключается в том, что подробные структурные сведения о белке часто недоступны, и, даже если они доступны, может быть очень сложно предсказать эффекты различных мутаций, поскольку структурная информация чаще всего дает статическую картину структуры белка. Однако в таких программах, как Folding @ home и Foldit использовались методы краудсорсинга, чтобы получить представление о мотивах сворачивания белков.
Вычислительный дизайн белка алгоритмы стремятся идентифицировать новые аминокислотные последовательности, которые имеют низкую энергию при свертывании до заранее заданной целевой структуры. В то время как пространство конформации последовательностей, которое необходимо найти, велико, наиболее сложным требованием для компьютерного дизайна белка является быстрая, но точная функция энергии, которая может отличать оптимальные последовательности от подобных субоптимальных.
Без структурной информации о белке анализ последовательности часто полезен для выяснения информации о белке. Эти методы включают выравнивание последовательностей целевого белка с последовательностями других родственных белков. Это выравнивание может показать, какие аминокислоты являются консервативными у разных видов и важны для функции белка. Эти анализы могут помочь идентифицировать горячие точки аминокислот, которые могут служить сайтами-мишенями для мутаций. Множественное выравнивание последовательностей использует базы данных, такие как PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE и BALIBASE, для перекрестной ссылки на последовательности целевого белка с известными последовательностями. Методы множественного выравнивания последовательностей перечислены ниже.
Этот метод начинается с выполнения попарного выравнивания последовательностей с использованием методов k-tuple или Needleman – Wunsch. Эти методы вычисляют матрицу, которая отображает попарное сходство между парами последовательностей. Затем оценки сходства преобразуются в оценки расстояния, которые используются для создания направляющего дерева с использованием метода соединения соседей. Это направляющее дерево затем используется для получения множественного выравнивания последовательностей.
Этот метод позволяет выравнивать до 190 000 последовательностей с использованием метода k-кортежей. Следующие последовательности группируются с использованием методов mBed и k-means. Затем строится направляющее дерево с использованием метода UPGMA, который используется пакетом HH align. Это направляющее дерево используется для генерации нескольких выравниваний последовательностей.
В этом методе используется быстрое преобразование Фурье (БПФ), которое преобразует аминокислотные последовательности в последовательность, состоящую из значений объема и полярности для каждой аминокислоты. кислотный остаток. Эта новая последовательность используется для поиска гомологичных областей.
В этом методе используется алгоритм приблизительного сопоставления строк Ву-Манбера для создания нескольких выравниваний последовательностей.
Этот метод использует расстояния Кмера и Кимуры для генерации множественных выравниваний последовательностей.
В этом методе используются целевые функции согласованности на основе дерева для эволюция выравнивания. Было показано, что этот метод на 5-10% более точен, чем Clustal W.
Коэволюционный анализ также известен как коррелированная мутация, ковариация или совместная замена. Этот тип рационального дизайна включает в себя взаимные эволюционные изменения в эволюционно взаимодействующих локусах. Обычно этот метод начинается с создания тщательно подобранных сравнений нескольких последовательностей для целевой последовательности. Это выравнивание затем подвергается ручному уточнению, которое включает удаление последовательностей с большим количеством пробелов, а также последовательностей с низкой идентичностью последовательностей. Этот шаг повышает качество выравнивания. Затем обработанное вручную выравнивание используется для дальнейших коэволюционных измерений с использованием различных алгоритмов коррелированных мутаций. Эти алгоритмы приводят к матрице оценки коэволюции. Эта матрица фильтруется путем применения различных тестов значимости для извлечения значимых значений коэволюции и устранения фонового шума. Коэволюционные измерения дополнительно оцениваются для оценки их эффективности и точности. Наконец, результаты этого коэволюционного анализа подтверждаются экспериментально.
Синтез белка de novo извлекает выгоду из знания существующих структур белка. Это знание существующей структуры белка помогает предсказывать новые структуры белка. Методы предсказания структуры белка подпадают под один из четырех следующих классов: ab initio, методы на основе фрагментов, моделирование гомологии и потоки белков.
Эти методы включают свободное моделирование без использования каких-либо структурная информация о шаблоне. Ab initio методы нацелены на предсказание нативных структур белков, соответствующих глобальному минимуму его свободной энергии. некоторыми примерами ab initio методов являются AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS и ENCEPP12. Общие шаги для ab initio методов начинаются с геометрического представления интересующего белка. Затем разрабатывается модель функции потенциальной энергии для белка. Эта модель может быть создана с использованием потенциалов молекулярной механики или потенциальных функций, полученных из структуры белка. После разработки потенциальной модели к белку применяются методы поиска энергии, включая молекулярно-динамическое моделирование, моделирование Монте-Карло и генетические алгоритмы.
Эти методы используют информацию базы данных о структурах для сопоставить гомологичные структуры с созданными последовательностями белка. Эти гомологичные структуры собираются для получения компактных структур с использованием процедур оценки и оптимизации с целью достижения наименьшего показателя потенциальной энергии. Веб-серверы для фрагментной информации: I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM и ANGLOR.
Эти методы являются на основе гомологии белков. Эти методы также известны как сравнительное моделирование. Первым шагом в моделировании гомологии обычно является идентификация шаблонных последовательностей известной структуры, которые гомологичны запрашиваемой последовательности. Затем последовательность запроса выравнивается с последовательностью шаблона. После выравнивания структурно консервативные области моделируются с использованием структуры шаблона. Затем следует моделирование боковых цепей и петель, отличных от шаблона. В итоге смоделированная конструкция проходит доработку и оценку качества. Серверы, доступные для данных моделирования гомологии, перечислены здесь: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA и I-TASSER.
Протеиновая нить может использоваться, когда не может быть найден надежный гомолог для последовательности запроса. Этот метод начинается с получения последовательности запроса и библиотеки шаблонных структур. Затем последовательность запросов распределяется по известным шаблонным структурам. Эти модели-кандидаты оцениваются с использованием функций оценки. Они оцениваются на основе моделей потенциальной энергии как запроса, так и последовательности шаблонов. Затем выбирается соответствие с моделью с наименьшим потенциалом энергии. Способы и серверы для получения данных потоковой передачи и выполнения вычислений перечислены здесь: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER3D, ESYPREDITS, RAPTOR, COTH, MUSTER.
Для получения дополнительной информации о рациональном дизайне см. сайт-направленный мутагенез.
Направленная эволюция, случайный мутагенез, например с помощью подверженной ошибкам ПЦР или мутагенеза с насыщением последовательности применяют к белку, и режим отбора используют для выбора вариантов, имеющих желаемые признаки. Затем применяются дополнительные раунды мутации и отбора. Этот метод имитирует естественную эволюцию и, в целом, дает лучшие результаты по сравнению с рациональным дизайном. Дополнительный процесс, называемый перетасовкой ДНК, смешивает и сопоставляет части успешных вариантов для получения лучших результатов. Такие процессы имитируют рекомбинацию, которая происходит естественным образом во время полового размножения. Преимущества направленной эволюции заключаются в том, что она не требует предварительных структурных знаний о протеине и не требует возможности предсказать, какой эффект будет иметь данная мутация. В самом деле, результаты экспериментов по направленной эволюции часто удивительны, поскольку желаемые изменения часто вызываются мутациями, от которых не ожидали какого-либо эффекта. Недостатком является то, что они требуют высокопроизводительного скрининга, который не применим для всех белков. Большие количества рекомбинантной ДНК должны быть мутированы, и продукты должны быть проверены на желаемые признаки. Большое количество вариантов часто требует дорогостоящего робототехнического оборудования для автоматизации процесса. Кроме того, не все желаемые действия можно легко отследить.
Естественная дарвиновская эволюция может быть эффективно воспроизведена в лаборатории в целях адаптации свойств белка для различных приложений, включая катализ. Существует множество экспериментальных технологий для создания больших и разнообразных библиотек белков и для скрининга или выбора свернутых функциональных вариантов. Свернутые белки неожиданно часто возникают в пространстве случайных последовательностей, что можно использовать при разработке селективных связывающих веществ и катализаторов. Будучи более консервативным, чем прямой отбор из глубокого пространства последовательностей, изменение конструкции существующих белков с помощью случайного мутагенеза и отбора / скрининга является особенно надежным методом оптимизации или изменения существующих свойств. Он также представляет собой отличную отправную точку для достижения более амбициозных инженерных целей. Объединение экспериментальной эволюции с современными вычислительными методами, вероятно, является самой широкой и наиболее плодотворной стратегией для создания функциональных макромолекул, неизвестных природе.
Основные проблемы разработки высококачественных мутантных библиотек продемонстрировали значительный прогресс в недавнем прошлом. Этот прогресс проявился в форме лучшего описания эффектов мутационных нагрузок на свойства белков. Кроме того, вычислительные подходы продемонстрировали значительный прогресс в области неисчислимого большого пространства последовательностей до более управляемых размеров, которые можно отсеивать, что позволило создать интеллектуальные библиотеки мутантов. Размер библиотеки также был уменьшен до большего размера, пригодного для скрининга, за счет идентификации ключевых полезных остатков с использованием алгоритмов систематической рекомбинации. Наконец, значительный шаг вперед к эффективному реинжинирингу ферментов был сделан с разработкой более точных статистических моделей и алгоритмов количественной оценки и прогнозирования сопряженных мутационных эффектов на функции белков.
В целом направленную эволюцию можно суммировать как итеративную двойку. поэтапный процесс, который включает создание библиотек мутантных белков и высокопроизводительные процессы скрининга для выбора вариантов с улучшенными характеристиками. Этот метод не требует предварительного знания структуры белка и взаимосвязи функций. Направленная эволюция использует случайный или сфокусированный мутагенез для создания библиотек мутантных белков. Случайные мутации могут быть введены с использованием либо подверженной ошибкам ПЦР, либо мутагенеза с насыщением сайтов. Мутанты также могут быть получены с использованием рекомбинации нескольких гомологичных генов. Природа выработала ограниченное количество полезных последовательностей. Направленная эволюция позволяет идентифицировать неоткрытые белковые последовательности, которые выполняют новые функции. Эта способность зависит от способности белков терпимо относиться к заменам аминокислотных остатков без нарушения фолдинга или стабильности.
Методы направленной эволюции можно в целом разделить на две стратегии: асексуальные и половые методы.
Бесполые методы не создают перекрестных связей между родительскими генами. Отдельные гены используются для создания мутантных библиотек с использованием различных мутагенных методов. Эти бесполые методы могут приводить к случайному или целенаправленному мутагенезу.
Способы случайного мутагена вызывают случайные мутации по всему интересующему гену. Случайный мутагенез может вызвать следующие типы мутаций: переходы, трансверсии, инсерции, делеции, инверсии, бессмысленность и бессмыслица. Примеры способов получения случайного мутагенеза приведены ниже.
ПЦР, подверженная ошибкам, основана на том факте, что ДНК-полимераза Taq не обладает 3 '- 5' экзонуклеазной активностью. Это приводит к частоте ошибок 0,001-0,002% на нуклеотид на репликацию. Этот метод начинается с выбора гена или участка в гене, который нужно мутировать. Затем рассчитывается степень требуемой ошибки на основе типа и степени активности, которую необходимо произвести. Эта степень ошибки определяет подходящую стратегию ПЦР, подверженную ошибкам. После ПЦР гены клонируют в плазмиду и вводят в компетентные клеточные системы. Затем эти клетки проверяются на наличие желаемых признаков. Затем выделяют плазмиды для колоний, которые демонстрируют улучшенные характеристики, и затем используют в качестве матриц на следующем этапе мутагенеза. ПЦР, подверженная ошибкам, показывает смещение одних мутаций по сравнению с другими. Например, смещения для переходов по сравнению с трансверсиями.
Уровень ошибок в ПЦР можно увеличить следующими способами:
Также см. полимеразная цепная реакция Чтобы получить больше информации.
Этот метод ПЦР основан на амплификации по катящемуся кругу, которая моделируется методом, который бактерии используют для амплификации кольцевой ДНК. Этот метод приводит к линейным дуплексам ДНК. Эти фрагменты содержат тандемные повторы кольцевой ДНК, называемые конкатамерами, которые можно трансформировать в бактериальные штаммы. Мутации вводятся путем сначала клонирования целевой последовательности в подходящую плазмиду. Затем процесс амплификации начинается с использованием случайных гексамерных праймеров и ДНК-полимеразы Ф29 в условиях амплификации, подверженной ошибкам. Дополнительными условиями для получения подверженной ошибкам амплификации по типу катящегося круга являются 1,5 пМ матричной ДНК, 1,5 мМ MnCl 2 и время реакции 24 часа. MnCl 2 добавляют в реакционную смесь, чтобы способствовать случайным точечным мутациям в цепях ДНК. Скорость мутаций может быть увеличена путем увеличения концентрации MnCl 2 или уменьшения концентрации матричной ДНК. Склонная к ошибкам амплификация по типу катящегося круга выгодна по сравнению с подверженной ошибкам ПЦР, поскольку в ней используются универсальные случайные гексамерные праймеры, а не специфические праймеры. Также продукты реакции этой амплификации не нужно обрабатывать лигазами или эндонуклеазами. Эта реакция изотермическая.
Химический мутагенез включает использование химических агентов для введения мутаций в генетические последовательности. Примеры химических мутагенов приведены ниже.
Бисульфат натрия эффективен при мутации геномных последовательностей, богатых G / C. Это связано с тем, что бисульфат натрия катализирует дезаминирование неметилированного цитозина до урацила.
Этилметансульфонат алкилирует остатки гуанидина. Это изменение вызывает ошибки во время репликации ДНК.
Азотистая кислота вызывает трансверсию путем деаминирования аденина и цитозина.
Двойной подход к случайному химическому мутагенезу представляет собой повторяющийся двухэтапный процесс. Во-первых, он включает химический мутагенез интересующего гена in vivo с помощью EMS. Затем обработанный ген выделяют и клонируют в необработанный вектор экспрессии, чтобы предотвратить мутации в остове плазмиды. Этот метод сохраняет генетические свойства плазмид.
Этот метод был использован для создания целевого мутагенеза in vivo у дрожжей. Этот метод включает слияние 3-метиладенин-ДНК-гликозилазы с ДНК-связывающим доменом tetR. Было показано, что это увеличивает скорость мутаций более чем в 800 раз в областях генома, содержащих сайты tetO.
Этот метод включает изменение длины последовательности путем одновременного удаление и вставка чанков баз произвольной длины. Было показано, что этот метод производит белки с новыми функциями за счет введения новых сайтов рестрикции, специфических кодонов, четырех основных кодонов для неприродных аминокислот.
В последнее время появилось много методов для основанного на транспозоне случайного мутагенеза не сообщалось. Эти методы включают, но не ограничиваются следующим: случайная циклическая перестановка PERMUTE, случайное усечение белка, случайная замена триплетов нуклеотидов, случайная вставка домена / метки / нескольких аминокислот, мутагенез со сканированием кодонов и мутагенез со сканированием мультикодонов. Все эти вышеупомянутые методы требуют создания транспозонов mini-Mu. Thermo Scientific производит наборы для создания этих транспозонов.
Эти методы включают изменение длины гена посредством инсерционных и делеционных мутаций. Примером является метод тандемной повторной вставки (TRINS). Этот метод приводит к генерации тандемных повторов случайных фрагментов целевого гена посредством амплификации по типу катящегося круга и одновременного включения этих повторов в целевой ген.
Мутаторные штаммы представляют собой бактериальные клетки линии, в которых отсутствует один или несколько механизмов репарации ДНК. Примером мутаторной цепи является E. coli XL1-RED. Этот подчиненный штамм E. coli не имеет путей репарации ДНК MutS, MutD, MutT. Использование штаммов-мутаторов полезно при введении многих типов мутаций; однако эти штаммы демонстрируют прогрессирующую болезнь культивирования из-за накопления мутаций в собственном геноме штаммов.
Целенаправленные мутагенные методы вызывают мутации в заранее определенных аминокислотных остатках. Эти методы требуют понимания взаимосвязи «последовательность-функция» для интересующего белка. Понимание этой взаимосвязи позволяет идентифицировать остатки, которые важны для стабильности, стереоселективности и каталитической эффективности. Примеры методов, которые производят сфокусированный мутагенез, приведены ниже.
Мутагенез с насыщением сайтов - это основанный на ПЦР метод, используемый для нацеливания на аминокислоты, играющие важную роль в функции белка. Двумя наиболее распространенными методами для выполнения этого являются одиночная ПЦР для всей плазмиды и ПЦР с перекрывающимся удлинением.
Одинарная ПЦР цельной плазмиды также называется сайт-направленным мутагенезом (SDM). Продукты SDM подвергаются расщеплению эндонуклеазой Dpn. Это расщепление приводит к расщеплению только родительской цепи, поскольку родительская цепь содержит GmATC, который метилирован по N6 аденина. SDM плохо работает для больших плазмид размером более десяти тысяч оснований. Кроме того, этот метод позволяет заменять только два нуклеотида за раз.
ПЦР с перекрывающимся удлинением требует использования двух пар праймеров. Один праймер в каждом наборе содержит мутацию. Выполняется первый раунд ПЦР с использованием этих наборов праймеров, и образуются два дуплекса двухцепочечной ДНК. Затем выполняется второй раунд ПЦР, в котором эти дуплексы денатурируются и снова отжигаются с набором праймеров для получения гетеродуплексов, в каждой цепи которых есть мутация. Любые пробелы в этих вновь образованных гетеродуплексах заполняются ДНК-полимеразами и далее амплифицируются.
Мутагенез с насыщением последовательностей приводит к рандомизации последовательности-мишени в каждом положении нуклеотида. Этот метод начинается с создания фрагментов ДНК переменной длины с универсальными основаниями с помощью матричных трансфераз на 3'-концах. Затем эти фрагменты растягиваются до полной длины с использованием однонитевого шаблона. Универсальные основания заменяются случайными стандартными основаниями, вызывая мутации. Существует несколько модифицированных версий этого метода, таких как SeSAM-Tv-II, SeSAM-Tv + и SeSAM-III.
Этот метод мутагенеза с насыщением сайтов включает две отдельные реакции ПЦР. В первой из них используются только прямые праймеры, а во второй реакции используются только обратные праймеры. Это позволяет избежать образования димера праймера.
Этот метод мутагенного насыщения сайтов начинается с одного мутагенного олигонуклеотида и одного универсального фланкирующего праймера. Эти два реагента используются для начального цикла ПЦР. Продукты из этого первого цикла ПЦР используются в качестве мега-праймеров для следующей ПЦР.
Этот мутагенный метод насыщения сайтов основан на ПЦР с удлинением перекрывания. Он используется для введения мутаций в любой сайт кольцевой плазмиды.
В этом методе используется определяемый пользователем сайт-направленный мутагенез одновременно в одном или нескольких сайтах. OSCARR - это аббревиатура от One Pot Simple Methodology for Cassette Randomization and Recombination. Эта рандомизация и рекомбинация приводят к рандомизации желаемых фрагментов белка. Omnichange - это независимый от последовательностей многоузловой мутагенез с насыщением, который может насыщать до пяти независимых кодонов в гене.
Этот метод удаляет повторяющиеся кодоны и стоп-кодоны.
Это метод на основе ПЦР. Кассетный мутагенез начинается с синтеза кассеты ДНК, содержащей интересующий ген, который фланкирован с обеих сторон сайтами рестрикции. Эндонуклеаза, которая расщепляет эти сайты рестрикции, также расщепляет сайты в целевой плазмиде. Кассету ДНК и плазмиду-мишень обрабатывают эндонуклеазами для расщепления этих сайтов рестрикции и образования липких концов. Затем продукты этого расщепления лигируют вместе, что приводит к встраиванию гена в плазмиду-мишень. Альтернативная форма кассетного мутагенеза, называемая комбинаторным кассетным мутагенезом, используется для определения функций отдельных аминокислотных остатков в интересующем белке. Рекурсивный ансамблевой мутагенез затем использует информацию из предыдущего комбинаторного кассетного мутагенеза. Мутагенез с кодонной кассетой позволяет вам вставлять или заменять одиночный кодон в определенном месте в двухцепочечной ДНК.
Сексуальные методы направленной эволюции включают рекомбинацию in vitro, которая имитирует естественную рекомбинацию in vivo. Обычно эти методы требуют высокой гомологии последовательностей между родительскими последовательностями. Эти методы часто используются для рекомбинации двух разных родительских генов, и эти методы действительно создают кроссинговеры между этими генами.
Гомологичная рекомбинация может быть классифицирована как in vivo или in пробирка. Гомологичная рекомбинация in vitro имитирует естественную рекомбинацию in vivo. Эти методы рекомбинации in vitro требуют высокой гомологии последовательностей между родительскими последовательностями. Эти методы используют естественное разнообразие родительских генов, рекомбинируя их для получения химерных генов. Полученные химеры демонстрируют смесь родительских характеристик.
Этот метод in vitro был одним из первых методов в эпоху рекомбинации. Он начинается с расщепления гомологичных родительских генов на небольшие фрагменты ДНКазой1. Эти небольшие фрагменты затем очищаются от непереваренных родительских генов. Затем очищенные фрагменты снова собирают с использованием ПЦР без праймера. В этой ПЦР участвуют гомологичные фрагменты из разных родительских генов, примирующие друг друга, в результате чего получается химерная ДНК. Химерная ДНК родительского размера затем амплифицируется с использованием концевых праймеров в обычной ПЦР.
Этот метод гомологичной рекомбинации in vitro начинается с синтеза множества коротких фрагменты гена, демонстрирующие точечные мутации, с использованием праймеров со случайной последовательностью. Эти фрагменты повторно собирают до полноразмерных родительских генов с помощью беспраймерной ПЦР. Эти повторно собранные последовательности затем амплифицируются с помощью ПЦР и подвергаются дальнейшим процессам отбора. Этот метод выгоден по сравнению с перетасовкой ДНК, потому что в нем не используется ДНКаза1, поэтому нет предвзятости для рекомбинации рядом с пиримидиновым нуклеотидом. Этот метод также выгоден благодаря использованию синтетических случайных праймеров, которые имеют одинаковую длину и не содержат систематических ошибок. Наконец, этот метод не зависит от длины матричной последовательности ДНК и требует небольшого количества родительской ДНК.
Этот метод генерирует химерные гены непосредственно из метагеномных образцов. Он начинается с выделения желаемого гена путем функционального скрининга из образца метагеномной ДНК. Затем конструируются специфические праймеры, которые используются для амплификации гомологичных генов из различных образцов окружающей среды. Наконец, создаются химерные библиотеки для извлечения желаемых функциональных клонов путем перетасовки этих амплифицированных гомологичных генов.
Этот метод in vitro основан на переключении матрицы для создания химерных генов. Этот основанный на ПЦР метод начинается с начальной денатурации матрицы, за которой следует отжиг праймеров и короткое время удлинения. Все последующие циклы вызывают отжиг между короткими фрагментами, созданными в предыдущих циклах, и различными частями шаблона. Эти короткие фрагменты и шаблоны отжигаются вместе на основе комплементарности последовательностей. Этот процесс отжига фрагментов матричной ДНК известен как переключение матрицы. Эти отожженные фрагменты затем будут служить праймерами для дальнейшего удлинения. Этот метод проводят до тех пор, пока не будет получена последовательность химерного гена родительской длины. Выполнение этого метода требует только начала фланкирующих праймеров. Также нет необходимости в ферменте ДНКаза 1.
Было показано, что этот метод генерирует библиотеки химерных генов со средним числом кроссоверов 14 на химерный ген. Он начинается с выравнивания фрагментов родительской верхней цепи с нижней цепью урацил-содержащей матрицы из гомологичного гена. 5 'и 3' выступающие створки расщеплены, а промежутки заполнены экзонуклеазной и эндонуклеазной активностями ДНК-полимераз Pfu и taq. Затем матрицу, содержащую урацил, удаляют из гетеродуплекса обработкой урацил-ДНК-гликозилазой с последующей амплификацией с использованием ПЦР. Этот метод выгоден тем, что он генерирует химеры с относительно высокой частотой кроссовера. Однако он несколько ограничен из-за сложности и необходимости создания одноцепочечной ДНК и урацила, содержащего одноцепочечную матричную ДНК.
Перетасовка синтетических вырожденных олигонуклеотидов добавляет гибкости методам перетасовки, поскольку могут быть включены олигонуклеотиды, содержащие оптимальные кодоны и полезные мутации.
Клонирование, выполняемое в дрожжах, включает зависимую от ПЦР повторную сборку фрагментированных векторов экспрессии. Эти повторно собранные векторы затем вводят в дрожжи и клонируют в них. Использование дрожжей для клонирования вектора позволяет избежать токсичности и контрселекции, которые могут возникнуть в результате лигирования и размножения в E. coli.
Это метод вводит мутации в определенные области генов, оставляя другие части нетронутыми за счет использования высокой частоты гомологичной рекомбинации в дрожжах.
В этом методе используется бактериофаг с модифицированный жизненный цикл для передачи развивающихся генов от хозяина к хозяину. Жизненный цикл фага устроен таким образом, что перенос коррелирует с интересующей активностью фермента. Этот метод имеет преимущество, поскольку он требует минимального вмешательства человека для непрерывной эволюции гена.
Эти методы основаны на том факте, что белки могут иметь сходную структурную структуру. идентичность при отсутствии гомологии последовательностей.
Перетасовка экзонов - это комбинация экзонов из разных белков в результате событий рекомбинации, происходящих в интронах. Перетасовка ортологичных экзонов включает объединение экзонов из ортологичных генов разных видов. Перетасовка ортологичных доменов включает перетасовку целых белковых доменов из ортологичных генов разных видов. Паралогичная перетасовка экзонов включает перетасовку экзонов из разных генов одного и того же вида. Перетасовка паралоговых доменов включает перетасовку целых белковых доменов из паралогичных белков одного и того же вида. Функциональная перетасовка гомологов включает перетасовку негомологичных доменов, которые функционально связаны. Все эти процессы связаны с амплификацией желаемых экзонов из разных генов с использованием химерных синтетических олигонуклеотидов. Эти продукты амплификации затем повторно собираются в гены полной длины с использованием ПЦР без праймера. Во время этих циклов ПЦР фрагменты действуют как матрицы и праймеры. В результате получают химерные полноразмерные гены, которые затем подвергаются скринингу.
Фрагменты родительских генов создаются с использованием контролируемого переваривания экзонуклеазой III. Эти фрагменты притупляются с помощью эндонуклеазы и лигируются для получения гибридных генов. THIOITCHY - это модифицированная технология ITCHY, в которой используются аналоги нуклеотидтрифосфата, такие как α-фосфотиоатные дНТФ. Включение этих нуклеотидов блокирует переваривание экзонуклеазой III. Это ингибирование переваривания экзонуклеазой III называется пиковым. Пикирование может быть выполнено путем усечения генов с помощью экзонуклеазы для создания фрагментов с короткими одноцепочечными выступами. Эти фрагменты затем служат в качестве матриц для амплификации ДНК-полимеразой в присутствии небольших количеств фосфотиоатных дНТФ. Эти полученные фрагменты затем лигируют вместе с образованием полноразмерных генов. В качестве альтернативы интактные родительские гены можно амплифицировать с помощью ПЦР в присутствии нормальных dNTP и фосфотиоатных dNTP. Эти продукты полноразмерной амплификации затем подвергаются расщеплению экзонуклеазой. Переваривание будет продолжаться до тех пор, пока экзонуклеаза не встретит α-pdNTP, в результате чего будут получены фрагменты разной длины. Затем эти фрагменты лигируют t вместе для создания химерных генов.
Этот метод генерирует библиотеки гибридных генов, ингибирующих множественные кроссоверы, путем комбинирования перетасовки ДНК и ITCHY. Этот метод начинается с создания двух независимых библиотек ITCHY. Первый с геном А на N-конце. А другой - с геном B на N-конце. Эти фрагменты гибридного гена разделяют либо с использованием переваривания рестриктазой, либо с помощью ПЦР с концевыми праймерами с помощью электрофореза в агарозном геле. Эти изолированные фрагменты затем смешивают и дополнительно расщепляют с помощью ДНКазы1. Затем расщепленные фрагменты повторно собирают с помощью беспраймерной ПЦР с переключением матрицы.
Этот метод генерирует библиотеки гибридных генов путем переключения матрицы однонаправленно растущих полинуклеотидов в наличие одноцепочечных фрагментов ДНК в качестве матриц для химер. Этот метод начинается с получения одноцепочечных фрагментов ДНК путем обратной транскрипции с целевой мРНК. Затем специфичные для генов праймеры отжигаются с одноцепочечной ДНК. Затем эти гены удлиняются во время цикла ПЦР. За этим циклом следует переключение матрицы и отжиг коротких фрагментов, полученных в результате более раннего удлинения праймера, на другие одноцепочечные фрагменты ДНК. Этот процесс повторяется до получения полноразмерной одноцепочечной ДНК.
Этот метод генерирует рекомбинацию между генами с небольшой гомологией последовательностей или без нее. Эти химеры сливаются через линкерную последовательность, содержащую несколько сайтов рестрикции. Затем эта конструкция переваривается с использованием DNase1. Фрагменты затупляются с помощью нуклеазы S1. Эти фрагменты с тупым концом соединяют в кольцевую последовательность путем лигирования. Затем эту кольцевую конструкцию линеаризуют с использованием рестрикционных ферментов, для которых рестрикционные сайты присутствуют в линкерной области. Это приводит к созданию библиотеки химерных генов, в которой вклад генов на 5 'и 3' конец будет обратным по сравнению с исходной конструкцией.
Этот метод приводит к созданию библиотеки генов с множественными кроссоверами нескольких родительских генов. Этот метод не требует идентичности последовательностей родительских генов. Это действительно требует одной или двух консервативных аминокислот в каждом положении кроссовера. Он начинается с выравнивания родительских последовательностей и идентификации консенсусных областей, которые служат сайтами кроссовера. За этим следует включение определенных тегов, содержащих сайты рестрикции, с последующим удалением тегов путем переваривания с помощью Bac1, в результате чего образуются гены со связанными концами. Эти фрагменты генов смешиваются и лигируются в соответствующем порядке с образованием химерных библиотек.
Этот метод начинается с выравнивания гомологичных генов с последующей идентификацией областей полиморфизма. Затем верхняя цепь гена делится на небольшие вырожденные олигонуклеотиды. Нижняя цепь также расщепляется на олигонуклеотиды, которые служат каркасом. Эти фрагменты объединяются в растворе, когда олигонуклеотиды верхней цепи собираются на олигонуклеотиды нижней цепи. Промежутки между этими фрагментами заполняются полимеразой и лигируются.
Этот метод включает перетасовку множества фрагментов ДНК без гомологии в одной ПЦР. Это приводит к реконструкции полных белков путем сборки модулей, кодирующих различные структурные единицы.
Этот метод начинается с амплификации фрагментов генов, которые необходимо рекомбинировать, используя урацил дНТФ. Этот раствор для амплификации также содержит праймеры, PfuTurbo и ДНК-полимеразу Cx Hotstart. Затем амплифицированные продукты инкубируют с ферментом USER. Этот фермент катализирует удаление остатков урацила из ДНК, создавая разрывы одной пары оснований. Фрагменты, обработанные ферментом USER, смешивают и лигируют с использованием ДНК-лигазы Т4 и подвергают расщеплению Dpn1 для удаления ДНК-матрицы. Эти полученные двухцепочечные фрагменты подвергаются амплификации с использованием ПЦР и трансформируются в E. coli.
Этот метод позволяет рекомбинировать по меньшей мере 9 различных фрагментов в акцепторном векторе с использованием фермента рестрикции типа 2, который разрезает за пределы сайтов рестрикции. Он начинается с субклонирования фрагментов в отдельных векторах для создания фланкирующих последовательностей Bsa1 с обеих сторон. Эти векторы затем расщепляют с использованием рестрикционного фермента типа II Bsa1, который генерирует четыре нуклеотидных однонитевых выступа. Фрагменты с комплементарными выступами гибридизуют и лигируют с использованием ДНК-лигазы Т4. Наконец, эти конструкции затем трансформируются в клетки E. coli, которые проверяются на уровни экспрессии.
Этот метод можно использовать для рекомбинации структурных элементов или целые белковые домены. Этот метод основан на химии фосфоротиоатов, которая позволяет специфическое расщепление фосфортиодиэфирных связей. Первый этап процесса начинается с амплификации фрагментов, которые необходимо рекомбинировать вместе с основной цепью вектора. Эта амплификация выполняется с использованием праймеров с фосфоротиолированными нуклеотидами на 5'-концах. Амплифицированные продукты ПЦР расщепляют в этанол-йодном растворе при высоких температурах. Затем эти фрагменты гибридизуют при комнатной температуре и трансформируют в E.coli, которая восстанавливает любые зазубрины.
Эта система основана на системе природной сайт-специфической рекомбинации в E. coli. Эта система называется интегронной и производит естественную перетасовку генов. Этот метод был использован для создания и оптимизации функционального оперона биосинтеза триптофана в trp-дефицитной E. coli путем доставки отдельных кассет рекомбинации или генов trpA-E вместе с регуляторными элементами с интегронной системой.
Этот метод генерирует одноцепочечные цепи ДНК, которые включают одноблочную последовательность на 5 'или 3' конце, комплементарные последовательности в области петли стебля и область D-ветви, служащую праймером. сайт связывания для ПЦР. Эквивалентные количества как 5'-, так и 3'-полуцепей смешивают и образуют гибрид из-за комплементарности в области стебля. Гибриды со свободным фосфорилированным 5'-концом в 3'-полуцепях затем лигируют со свободными 3'-концами в 5'-полунити с использованием ДНК-лигазы Т4 в присутствии 0,1 мМ АТФ. Затем лигированные продукты амплифицируют с помощью двух типов ПЦР для получения продуктов ПЦР до 5 ', половины и до 3'. Эти продукты ПЦР превращаются в одноцепочечные путем связывания авидин-биотин с 5'-концом праймов, содержащих последовательности стебля, которые были мечены биотином. Затем биотинилированные 5'-полунити и небиотинилированные 3'-полунити используются как 5'- и 3'-полунити для следующего цикла Y-лигирования.
Полунити -рациональный дизайн использует информацию о последовательности, структуре и функции белков в тандеме с алгоритмами прогнозирования. Вместе они используются для идентификации целевых аминокислотных остатков, которые с наибольшей вероятностью влияют на функцию белка. Мутации этих ключевых аминокислотных остатков создают библиотеки мутантных белков, которые с большей вероятностью будут иметь улучшенные свойства.
Достижения в области полурациональной ферментной инженерии и разработки ферментов de novo предоставляют исследователям новые мощные и эффективные стратегии для манипулирования биокатализаторами. Интеграция подходов, основанных на последовательностях и структурах, в дизайне библиотек оказалась отличным руководством для модернизации ферментов. Как правило, текущие вычислительные de novo и методы модернизации не сравниваются с усовершенствованными вариантами каталитических характеристик. Хотя экспериментальная оптимизация может быть произведена с использованием направленной эволюции, дальнейшее повышение точности предсказаний структуры и большая каталитическая способность будут достигнуты за счет улучшений в алгоритмах проектирования. Дальнейшие функциональные улучшения могут быть включены в будущие симуляции за счет интеграции динамики белков.
Биохимические и биофизические исследования, наряду с точной настройкой прогностических структур, будут полезны для экспериментальной оценки функциональной значимости отдельных конструктивных особенностей. Лучшее понимание этого функционального вклада затем даст обратную связь для улучшения будущих проектов.
Направленная эволюция, вероятно, не будет заменена в качестве метода выбора для белковой инженерии, хотя вычислительный дизайн белка фундаментально изменил способ белковой инженерии может манипулировать биомакромолекулами. Более мелкие, более сфокусированные и функционально богатые библиотеки могут быть созданы с использованием методов, которые включают в себя прогностические структуры для основанной на гипотезах инженерии белков. Новые стратегии проектирования и технические достижения положили начало отходу от традиционных протоколов, таких как направленная эволюция, которая представляет собой наиболее эффективную стратегию для выявления наиболее эффективных кандидатов в специализированных библиотеках. Синтез библиотеки целых генов заменяет протоколы перетасовки и мутагенеза для подготовки библиотеки. Кроме того, вместо монументального скрининга и отбора миллионов кандидатов все чаще применяются высокоспецифичные скрининговые тесты с низкой пропускной способностью. Вместе эти разработки позволят вывести белковую инженерию за рамки направленной эволюции и перейти к практическим, более эффективным стратегиям адаптации биокатализаторов.
После того, как белок прошел направленную эволюцию, разработка рациона или дизайн полу-рациона, библиотеки мутантных белков должны быть проверены, чтобы определить, какие мутанты проявляют улучшенные свойства. Методы фагового дисплея - один из вариантов скрининга белков. Этот метод включает слияние генов, кодирующих вариантные полипептиды, с генами белка оболочки фага. Варианты белков, экспрессируемые на поверхности фагов, отбирают путем связывания с иммобилизованными мишенями in vitro. Затем фаги с выбранными вариантами белка амплифицируют в бактериях с последующей идентификацией положительных клонов с помощью иммуноферментного анализа. Эти отобранные фаги затем подвергают секвенированию ДНК.
Системы отображения клеточной поверхности также можно использовать для скрининга библиотек мутантных полипептидов. Библиотечные мутантные гены включаются в векторы экспрессии, которые затем трансформируются в соответствующие клетки-хозяева. Эти клетки-хозяева подвергаются дальнейшим высокопроизводительным методам скрининга для идентификации клеток с желаемыми фенотипами.
Системы бесклеточного отображения были разработаны для использования трансляции белка in vitro или бесклеточной трансляции. Эти методы включают отображение мРНК, отображение рибосом, отображение ковалентной и нековалентной ДНК, а также компартментализацию in vitro.
Ферментная инженерия - это применение модификации структуры фермента (и, таким образом, его функция) или изменение каталитической активности изолированных ферментов для производства новых метаболитов, для обеспечения новых (каталитических) путей протекания реакций или для преобразования одних соединений в другие (биотрансформация ). Эти продукты используются в качестве химикатов, фармацевтических препаратов, топлива, пищевых продуктов или сельскохозяйственных добавок.
Ферментный реактор состоит из емкости, содержащей реакционную среду, которая используется для выполнения желаемого преобразования ферментативными средствами. Ферменты, используемые в этом процессе, не содержатся в растворе.
Вычислительные методы были использованы для создания белка с новой складкой, названного Top7, и сенсоров для неестественных молекул. Разработка слитых белков привела к получению рилонацепта, фармацевтического препарата, который получил одобрение Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) для лечения криопирин-ассоциированного периодического синдрома..
Другой вычислительный метод, IPRO, успешно спроектировал переключение кофакторной специфичности ксилозоредуктазы Candida boidinii. Итеративная переработка и оптимизация белков (IPRO) модифицирует белки для увеличения или придания специфичности нативным или новым субстратам и кофакторам. Это делается путем многократного случайного возмущения структуры белков вокруг указанных проектных положений, определения комбинации с наименьшей энергией ротамеров и определения того, имеет ли новый дизайн более низкую энергию связывания, чем предыдущие.
Проектирование с помощью вычислений также использовалось для конструирования сложных свойств высокоупорядоченной сборки нанобелков. Белковая клетка, бактериоферритин E. coli (EcBfr), который естественным образом демонстрирует структурную нестабильность и неполное самосборное поведение, заселяя два состояния олигомеризации, является модельным белком в этом исследовании. Путем компьютерного анализа и сравнения с его гомологами было обнаружено, что этот белок имеет димерный интерфейс меньше среднего на его двукратной оси симметрии, главным образом из-за существования водный карман на границе раздела с двумя связанными с водой остатками аспарагина. Чтобы исследовать возможность конструирования EcBfr для модифицированной структурной стабильности, полуэмпирический вычислительный метод используется для виртуального изучения энергетических различий 480 возможных мутантов на димерном интерфейсе относительно EcBfr дикого типа. Это вычислительное исследование также сходится на изучении аспарагина с водным мостиком. Замена этих двух аспарагинов на гидрофобные аминокислоты приводит к образованию белков, которые сворачиваются в альфа-спиральные мономеры и собираются в клетки, что подтверждается круговым дихроизмом и просвечивающей электронной микроскопией. И термическая, и химическая денатурация подтверждают, что все переработанные белки, в соответствии с расчетами, обладают повышенной стабильностью. Одна из трех мутаций сдвигает популяцию в пользу состояния олигомеризации более высокого порядка в растворе, что показано как эксклюзионной хроматографией, так и электрофорезом в нативном геле.
Метод in silico, PoreDesigner, был успешно разработан для изменения конструкции бактериального канала протеина (OmpF), чтобы уменьшить размер пор с 1 нм до любого желаемого размера субнм. Эксперименты по переносу на наиболее узких порах показали полное отторжение солей при сборке в биомиметических блок-полимерных матрицах.
