Альтернативный сплайсинг

редактировать
Процесс, с помощью которого один ген может кодировать несколько белков Альтернативный сплайсинг дает три изоформы белка .

Альтернатива сплайсинг, или альтернативный сплайсинг РНК, или дифференциальный сплайсинг, представляет собой регулируемый процесс во время экспрессии гена, который приводит к одному гену кодирование нескольких белков. В этом процессе принимают экзоны гены могут быть или включены исключены из конечной процессированной матричной РНК (мРНК), полученной из этого гена. Следовательно, белки , транслируемые из альтернативно сплайсированных мРНК, содержат различия в их аминокислотной последовательности, часто, в их биологических функциях (см. Рисунок). Примечательно, что альтернативный сплайсинг позволяет геному человека управлять синтезом большего количества белков, чем можно было бы ожидать от его 20 000 генов, кодирующих белок.

Альтернативный сплайсинг происходит как нормальное явление у эукариот, где он увеличивает биоразнообразие белков, которые могут кодироваться геномом; у людей ~ 95% мультиэкзонных генов альтернативно сплайсированы. Наблюдается множество способов альтернативного сплайсинга, из наиболее распространенного пропускания экзона. В этом режиме конкретный экзон может быть включен в мРНК в одних условиях или в определенных тканях и исключен из мРНК в других.

Производство альтернативно сплайсированных мРНК регулируется системой транс -активные белки, которые связываются с цис-действующими сайтами на самом первичном транскрипте. Такие белки, которые включают активаторы сплайсинга, способствуют использованию определенного сайта сплайсинга, и репрессоры сплайсинга, которые сокращают использование определенного сайта. Механизмы альтернативного сращивания очень разнообразны, и находят новые примеры, особенно постоянно за счет использования высокопроизводительных методов. Исследователи надеются полностью выяснить регуляторные системы, участвующие в сплайсинге, чтобы альтернативные продукты сплайсинга из данного гена в определенных условиях («варианты сплайсинга») можно было предсказать с помощью «кода сплайсинга».

Аальные вариации в сплайсинге также вовлечены в заболевание ; большая часть человеческих генетических нарушений возникает в результате вариантов сплайсинга. Также считается, что аномальные варианты сплайсинга способствуют развитию рака, а гены факторов сплайсинга часто мутируют при различных типах рака.

Содержание

  • 1 Discovery
  • 2 режима
  • 3 Механизмы
    • 3.1 Общий механизм сплайсинга
    • 3.2 Регуляторные элементы и белки
    • 3.3 Метилирование ДНК и альтернативный сплайсинг у социальных насекомых
    • 3.4 Примеры
      • 3.4.1 Пропуск экзона: Drosophila dsx
      • 3.4.2 Альтернативные акцепторные сайты: Drosophila Трансформатор
      • 3.4.3 Определение экзона: рецептор Fas
      • 3.4.4 Конкуренция репрессор-активатор: ВИЧ-1 tat экзон 2
  • 4 Адаптивная значимость
  • 5 Заболевание
  • 6 Полногеномный анализ
  • 7 Базы данных
  • 8 См. Также
  • 9 Ссылки
  • 10 Внешние ссылки

Discovery

Альтернативный сплайсинг был впервые впервые в 1977 году. Аденовирус производит пять первичных транскриптов в начале своего инфекционного цикла, до репликации вирусной ДНК, и еще один - позже, после начала репликации ДНК. Первые первичные транскрипты продолжают вырабатывать после начала репликации ДНК. Дополнительный первичный транскрипт, продуцируемый на поздних стадиях заражения, является большим и происходит из 5/6 генома аденовируса размером 32 КБ. Это намного больше, чем любая из отдельных мРНК аденовируса, присутствующих в инфицированных клетках. Исследователи представляют, что первичный транскрипт РНК, продуцируемый аденовирусом типа 2 на поздней стадии, был сплайсирован множеством различных способов, в результате чего были получены мРНК, кодирующие различные вирусные белки. Кроме того, первичный транскрипт содержит несколько полиаденилирования, дающих разные 3'-концы для процессированных мРНК.

В 1981 году представлен первый пример альтернативного сплайсинга в транскрипте от нормального, эндогенного гена. Было обнаружено, что ген, кодирующий тироидный гормон кальцитонин, альтернативно сплайсирован в клетках млекопитающих. Первичный транскрипт этого гена содержит 6 экзонов; мРНК кальцитонина содержит экзоны 1–4 и оканчивается после сайта полиаденилирования в экзоне 4. Другая мРНК продуцируется из этого пре-мРНК путем пропуска экзона 4 и включает экзоны 1– 3, 5 и 6 Он кодирует белок, известный как CGRP (пептид, родственный гену кальцитонина ). Примеры альтернативного сплайсинга в транскриптах гена иммуноглобина у млекопитающих также наблюдались в начале 1980-х.

С тех пор было обнаружено, что альтернативный сплайсинг повсеместно встречается у эукариот. «Рекордсменом» альтернативного сплайсинга является геном D. melanogaster под названием Dscam, который может иметь 38 016 вариантов сплайсинга.

Режимы

Традиционная классификация основных типов альтернативных РНК сращивание событий. Экзоны представлены в виде синих и желтых блоков, интроны - в виде линий между ними. Относительная частота типов событий альтернативного сплайсинга у людей и плодовых мушек различается.

Общепризнано основных пяти способов альтернативного сплайсинга.

  • Экзон пропуск или кассетного экзона : в этом случае экзон может быть сплайсирован из первичного транскрипта или сохранен. Это наиболее распространенный способ пре-мРНК млекопитающих.
  • Взаимоисключающие экзоны : один из двух экзонов сохраняется в мРНК после сплайсинга, но не оба.
  • Альтернативный донорский сайт : Используется альтернативное 5'-сплайсинговое соединение (донорный сайт), изменяя 3'-границу вышестоящего экзона.
  • Альтернативный акцепторный сайт : используется альтернативный 3'-сплайсинговый стык (акцепторный сайт), изменяя 5'-границу нижележащего экзона.
  • Удержание интрона : Последовательность может быть сплайсирована как интрон или просто сохранена. Это отличается от пропуска экзонов, потому что сохраненная последовательность не фланкируется интронами. Если сохраненный интрон находится в кодирующей области, интрон должен кодировать аминокислоты в рамке с соседними экзонами, иначе стоп-кодон или сдвиг в рамке считывания приведет к тому, что станет нефункциональным. Это самый редкий способ у млекопитающих.

В дополнение к основным основным способам альтернативного сплайсинга существуют два других основных механизма, с помощью которых разные мРНК могут генерироваться из одного и того же гена; множественные промоторы и множественные сайты полиаденилирования. Использование множественных промоторов правильно описанной как механизм регуляции транскрипции, а не как альтернативный сплайсинг; Начав транскрипцию в разных точках, можно получить транскрипты с разными 5'-экзонами. С другой стороны, несколько сайтов полиаденильных точек разные 3'-конечные точки для транскрипта. Оба этих механизма используются в комбинации с альтернативным сплайсингом и дополнительное разнообразие мРНК, происходящих из гена.

Схематическое отсечение от 3 структур сплайсинга в гене гиалуронидазы мыши. Направленность транскрипции от 5 'до 3' направо слева. Экзоны и интроны не масштабированы.

. Эти режимы описывают основные механизмы сплайсинга, но могут быть неадекватными для описания сложных событий сплайсинга. Например, на рисунке справа показаны 3 сплайс-формы из гена гиалуронидазы 3 мыши. Сравнение экзонной структуры, показанной в первой строке (желтая) показывает, как сравнение между и второй системой удержания интронов, тогда как сравнение между и второй формой сплайсинга (желтый против синего) показывает пропуск экзона. Недавно была предложена модельная номенклатура для однозначного обозначения всех паттернов сплайсинга.

Механизмы

Общий механизм сплайсинга

Сплайсосома Комплекс определяет 5 'и 3' концы интрона перед удалением

Когда пре-мРНК была транскрибирована из ДНК, она включает несколько интронов и экзонов. (У нематод среднее значение составляет 4-5 экзонов и интронов; у плодовой мушки Drosophila в одной транскрибированной пре-мРНК может быть более 100 интронов и экзонов.) Экзоны должны сохраняться в мРНК, определяет в процессе сплайсинга. Регуляция и отбор сайтов сплайсинга осуществляются транс-действующим активатором сплайсинга и репрессорными белками сплайсинга, а также цис-действующими элементами в самой пре-мРНК, такими как энхансеры экзонного сплайсинга и сайленсеры экзонного сплайсинга.

Типичный ядерный интрон эукариот имеет консенсусные последовательность, определяющие важные области. Каждый интрон имеет последовательность ГУ на 5'-конце. Рядом с 3-м концом есть филиал. Нуклеотид в точке ветвления всегда представляет собой A; консенсус относительно этой последовательности несколько различается. У человека консенсусной последовательностью сайта ветвления является yUnAy. За сайтом ответвления следует ряд пиримидинов - полипиримидиновый тракт - затем AG на 3'-конце.

Сплайсинг мРНК осуществляется с помощью РНК и белковый комплекс, известный как сплайсосома, обеспечивает snRNP, обозначенный U1, U2, U4, U5 и U6 (U3 не участвует в сплайсинге мРНК). U1 связывается с 5 'GU, а U2 с помощью белковых факторов U2AF связывается с точкой разветвления A внутри сайта ветвления. Комплекс на этой стадии известен как комплекс сплайсосомы А. Формирование комплекса A обычно является ключевым этапом в определении концов интрона, вводящего сплайсингу, определяющим и окончательным экзона, которые необходимо сохранить. (Номенклатура U обусловлена ​​высоким содержанием уридина).

Связывается комплекс U4, U5, U6, а U6 заменяет позицию U1. U1 и U4 уходят. Оставшийся комплекс двух реакций переэтерификации. При первой переэтерификации 5'-конец интрона отщепляется от вышележащего экзона и присоединяется к сайту разветвления A с помощью 2 ', 5'- фосфодиэфирной связи. При втором переэтерификации 3'-конец интрона отщепляется от расположенного ниже экзона, и два экзона соединяются фосфодиэфирной связью. Затем интрон высвобождается в форме лариата и разрушается.

Регуляторные элементы и белки

Репрессия сплайсинга

Сплайсинг регулируется транс-действующими белками (репрессорами и активаторами) и продукт цис-действующие регуляторные сайты (сайленсеры и энхансеры) на пре-мРНК. Однако, как часть сложности альтернативного сращивания, следует отметить, что эффекты фактора сращивания часто зависит от положения. То есть фактор сплайсинга, который служит активатором сплайсинга, когда он связан с интронным энхансерным элементом, может служить репрессором, когда он связан с его элементом сплайсинга в контексте экзона, и наоборот. Вторичная структура транскрипта пре-мРНК также играет роль в регуляции сплайсинга, например, путем объединения элементов сплайсинга или путем маскирования, которая в противном случае выполняет функцию связывания для фактора сплайсинга. Вместе эти элементы образуют «код сплайсинга», который управляет тем, как сплайсинг будет происходить в разных клеточных условиях.

Существует два основных типа цис-действующих элементов, содержащих РНК, присутствующих в пре-мРНК и они имеют соответствующие трансактирующие РНК-связывающие белки. Сайленсеры сплайсинга - это сайты, с которыми связываются белки-репрессоры сплайсинга, что снижает вероятность того, что соседний сайт будет подключено в качестве соединения сплайсинга. Они могут быть расположены в самом интроне (сайленсеры интронного сплайсинга, ISS) или в соседнем экзоне (сайленсеры экзонного сплайсинга, ESS). Они различаются по наблюдениям, а также по типам белков, которые с ними связываются. Большинство репрессоров сплайсинга представляют собой гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (hnRNPs), такие как hnRNPA1 и белок, связывающий полипиримидиновый тракт (PTB). Энхансеры сплайсинга - это сайты, с которыми связываются белки-активаторы сплайсинга, увеличивая вероятность того, что соседний сайт будет подключаться в качестве соединения сплайсинга. Они также могут возникнуть в интроне (энхансеры интронного сплайсинга, ISE) или экзоне (энхансеры экзонного сплайсинга, ESE). Большинство белков-активаторов связываются с ISE и ESE, членами семейства SR-белков. Такие белки содержаты распознавания РНК и домены, богатые аргинином и серином (RS).

Активация сплайсинга

В общем, детерминанты сплайсинга работают взаимозависимо, что зависит от контекста, так что правила, определяющие, как сварка регулируется с помощью кода сварки. Присутствие конкретного элемента соответствует цис-действующей РНК может увеличить вероятность того, что соседний сайт будет сплайсирован в некоторых случаях, но снизить вероятность в других случаях, в зависимости от контекста. Контекст, включает в себя действующий регуляторные элементы, цис- контекст, который содержит другие стандартные РНК, и транс-действующий контекст, который устанавливает клеточные условия. Например, некоторые элементы последовательности цис-действующей РНК воздействует на сплайсинг только в том случае, если несколько элементов присутствуют в одной и той же области, чтобы установить контекст. В качестве другого примера, цис-действующий элемент может иметь противоположные эффекты на сплайсинг, в зависимости от того, какие белки экспрессируются в клетке (например, нейронный PTB по сравнению с ненейрональным). Адаптивное значение сайленсеров и энхансеров для сплайсинга подтверждено исследованиями, показывающими, что в человеческих генах существует сильный отбор против мутаций, которые производят новые сайленсеры или разрушают усили энхансеры.

Метилирование ДНК и альтернативный сплайсинг у социальных насекомых

Метилирование ДНК 180>CpG показало свою роль в регулировании альтернативного сплайсинга у социальных насекомых. У медоносных пчел (Apis mellifera) метилирование ДНК CpG, по-видимому, регулирует пропуск экзонов на основании нескольких геномных исследований после того, как геном медоносной пчелы был доступен. Метилирование ДНК CpG более широко регулирует альтернативный сплайсинг, не только влияет на пропуск экзонов, но также на удержание интронов и другие события сплайсинга.

Примеры

Пропуск экзона: Drosophila dsx

Альтернативный сплайсинг dsx пре-мРНК

Пре-мРНК из гена D. melanogaster dsx содержит 6 экзонов. У мужчин экзоны 1, 2, 3, 5 и 6 соединяются с образованием мРНК, которая кодирует белок, регулирующий транскрипцию, необходимую для развития самцов. У самок экзоны 1,2,3 и 4 соединены, и сигнал полиаденилирования в экзоне 4 вызывает расщепление мРНК в этой точке. Полученная мРНК представляет собой белок, регулирующий транскрипцию, необходимый для развития самок.

Это пример пропуска экзона. Интрон, расположенный выше экзона 4, имеет полипиримидиновый тракт, который не соответствует консенсусной последовательной, так что белки U2AF плохо связываются с ней без помощи активаторов сплайсинга. Таким образом, этот 3'-акцепторный сайт сплайсинга не используется у мужчин. Самки же производят активатор сращивания Transformer (Tra) (см. Ниже). SR-белок Tra2 продуцируется у обоих полов и связывается с ESE в экзоне 4; если Tra присутствует, он связывается с другими белком SR образует комплекс, который помогает белкам U2AF связывается со слабым полипиримидиновым трактом. U2 рекрутируется в ассоциированную точку ветвления, и это приводит к включению экзона 4 в мРНК.

Альтернативные акцепторные сайты: трансформер дрозофилы

Альтернативный сплайсинг продукта гена трансформера дрозофилы.

Пре-мРНК гена трансформера (Tra) Drosophila melanogaster подвергают альтернативному сплайсингу через режим альтернативного акцепторного сайта. Ген Tra кодирует белок, экспрессируется только у женщин. Первичный транскрипт этого гена содержит интрон с двумя возможными акцепторными сайтами. У самцов используется восходящий акцепторный сайт. Это приводит к включению более длинной версии экзона 2 в обработанный транскрипт, включая ранний стоп-кодон . Полученная мРНК кодирует усеченный белковый продукт, который неактивен. Самки производят основной белок определения пола (Sxl). Белок Sxl представляет собой репрессор сплайсинга, который связывается с ISS в РНК транскрипта Tra рядом с восходящим акцепторным сайтом, предотвращает связывание белка U2AF с полипиримидиновым трактом. Это предотвращает использование этого соединения, сдвигая связывание сплайсосомы на расположенный ниже акцепторный сайт. Сплайсинг в этот момент обходит стоп-кодон, который вырезается как часть интрона. Полученная мРНК кодирует активный белок Tra, который сам по себе является регулятором альтернативного сплайсинга других связанных с полом генов (см. Dsx выше).

Определение экзона: рецептор Fas

Альтернативный сплайсинг рецептора Fas pre -мРНК

Множественные изоформы белка рецептора Fas продуцируются альтернативным сплайсингом. Две обычно встречающиеся у человека изоформы продуцируются механизмом пропуска экзонов. МРНК, включающая экзон 6, кодирует мембраносвязанную форму рецептора Fas, которая способствует апоптозу или запрограммированной гибели клеток. Повышенная экспрессия рецептора Fas в клетках кожи, хронически подвергающихся воздействию солнца, и отсутствие экспрессии в раковых клетках кожи предполагает, что этот механизм может иметь важное значение для устранения предраковых клеток у людей. Если экзон 6 пропущен, полученная мРНК кодирует растворимый белок Fas, который не способствует апоптозу. Включение или пропуск экзона зависит от двух антагонистических белков, TIA-1 и белка, связывающего полипиримидиновый тракт (PTB).

  • 5'-донорный сайт в интроне ниже экзона 6 в пре-мРНК имеет слабое согласие с консенсусной последовательностью и обычно не связывается с мяРНП U1. Если U1 не связывается, экзон пропускается (см. «A» на прилагаемом рисунке).
  • Связывание белка TIA-1 с сайтом интронного энхансера сплайсинга стабилизирует связывание snRNP U1. Образовавшийся комплекс 5'-донорных сайтов способствует связыванию фактора сплайсинга U2AF с 3'-сайтом сплайсинга перед экзоном посредством механизма, который еще не известен (см. B).
  • Экзон 6 содержит пиримидин -богатый экзонный глушитель сплайсинга, ure6, где может связываться PTB. Если PTB связывается, он подавляет эффект 5'-донорного комплекса на связывание U2AF с акцепторным сайтом, что приводит к пропуску экзона (см. C).

Этот механизм является примером определения экзона при сплайсинге. Сплайсосома собирается на интроне, и субъединицы мяРНП сворачивают РНК, так что 5 'и 3' концы интрона соединяются. Однако недавно изученные примеры, подобные этому, показывают, что также существуют взаимодействия между концами экзона. В данном конкретном случае эти взаимодействия по определению экзона необходимы для связывания ядерных факторов сплайсинга до сборки сплайсосом на двух фланкирующих интронах.

Конкуренция репрессор-активатор: ВИЧ-1 tat экзон 2

Альтернативный сплайсинг tat экзона 2 ВИЧ-1

ВИЧ, ретровирус, вызывающий СПИД у людей, продуцирует единственный первичный транскрипт РНК, который альтернативно сплайсируется в несколько способов производства более 40 различных мРНК. Равновесие междудифференцированно сплайсированными транскриптами множества мРНК, кодирующих различные продукты, необходимые для размножения вирусов. Один из дифференциально сплайсированных транскриптов содержит ген tat, в котором экзон 2 представляет собой кассетный экзон, который может быть пропущен или включен. Включение экзона 2 tat в РНК регулируется конкуренцией между репрессором сплайсинга hnRNP A1 и SR-белком SC35. Внутри экзона 2 последовательность сайленсера экзонного сплайсинга (ESS) и последовательность энхансера экзонного сплайсинга (ESE) перекрываются. Если белок-репрессор A1 связывается с ESS, он запускает кооперативное связывание множества молекул A1, распространяясь в 5’-донорский сайт перед экзоном 2 и предотвращая связывание основного фактора сплайсинга U2AF35 с полипиримидиновым трактом. Если SC35 связывается с ESE, он предотвращает связывание A1 и поддерживает 5’-донорный сайт в доступном состоянии для сборки сплайсосомы. Конкуренция между активатором и репрессором гарантирует, что продуцируются оба типа мРНК (с экзоном 2 и без него).

Адаптивная значимость

Альтернативный сплайсинг - одно из нескольких исключений из исходной идеи, что одна последовательность ДНК кодирует один полипептид (гипотеза «Один ген - один фермент» ). Правильнее было бы сейчас сказать: «Один ген - много полипептидов». Внешняя информация необходима для того, чтобы решить, какой полипептид продуцируется с учетом ДНК и пре-мРНК. Методы регуляции наследуются, это обеспечивает новые способы воздействия мутаций на экспрессию генов.

Было высказано предположение, что для эукариот альтернативный сплайсинг был очень важным шагом на пути повышения эффективности, потому что информацию можно хранить гораздо экономичнее. Несколько белков могут кодироваться одним геном вместо того, чтобы требовать отдельного гена для каждого, что позволяет получить более разнообразный протеом из генома ограниченного размера. Это также эволюционная гибкость. Единичная точечная мутация может приводить к тому, что данный экзон может иногда включаться в транскрипт во время сплайсинга, что позволяет выполнять новую изоформу белка без потерь исходной белка. Исследования идентифицированы внутренне неупорядоченные области (см. Внутренние неструктурированные белки ) как обогащенные неконституционными экзонами, предполагая, что изоформы могут проявлять функциональное разнообразие из-за изменения функциональных модулей в этих областях. Такое функциональное разнообразие, достигаемое изоформами, отражается в паттернах их экспрессии и может быть предсказано подходами машинного обучения. Сравнительные исследования показывают, что альтернативный сплайсинг предполагает многоклеточность в эволюции, и предполагают, что этот механизм может быть использован для развития многоклеточных организмов.

Исследования, основанные на Проект генома человека и другое секвенирование генома показало, что у человека только примерно на 30% больше генов, чем у круглого червя Caenorhabditis elegans, и только примерно в два раза больше, чем у мухи Drosophila melanogaster. Это открытие предполагает предположение, что предполагаемая большая сложность или позвоночных в целом может быть связана с более высокими показателями альтернативного сплайсинга у людей, чем у беспозвоночных. Однако исследование образцов по 100 000 EST от человека, мыши, крысы, коровы, мухи (D. melanogaster), червя (C. elegans) и растения Arabidopsis thaliana не было больших различных в альтернативно сплайсированных генов у людей и других протестированных животных. Другое исследование, однако, предположило, что результаты были артефактом различного количества EST, доступных для различных организмов. Когда они сравнили альтернативные частоты сплайсинга в случайных подмножествах генов каждого организма, авторы пришли к выводу, что у позвоночных действительно более высокий уровень альтернативного сплайсинга, чем у беспозвоночных.

Изменения в механизме обработки РНК могут привести к неправильному сплайсингу нескольких транскриптов, в то время как однонуклеотидные изменения в сайтах сплайсинга или цис-действующих регуляторных сайтовх сплайсинга могут приводить к функциям в сплайсинге одного гена и, таким образом, в мРНК, полученной из транскриптов мутантного гена. Исследование 2005 г., включающее вероятностный анализ, показало, что более 60% вызывающих заболеваний людей мутаций влияет на сплайсинг, а не непосредственно на кодирующие наблюдающие. Более недавнее исследование показывает, что одна треть всех наследственных заболеваний, вероятно, связанных со сплайсингом. Независимо от точного процента, существует ряд заболеваний, связанных со сплайсингом. Как описано ниже, ярким примером заболеваний, связанным со сплайсингом, является рак.

Аномально сплайсированные мРНК также обнаруживаются в большом количестве раковых клеток. Комбинированный анализ RNA-Seq и протеомика выявил поразительную дифференциальную экспрессию изоформ сплайсинга ключевых белков в важных путях рака. Не всегда ясно, вносит ли такие аберрантные паттерны сплайсинга вклад в качественный рост или просто следствие клеточных аномалий, связанных с раком. Было показано, что для определенных типов рака, как колоректальный рак и рак простаты, количество ошибок сплайсинга на рак сильно отличается между отдельными видами рака, явления, называемое нестабильностью транскриптома. Кроме того, было показано, что нестабильность транскриптома коррелирует со сниженным уровнем экспрессии генов факторов сплайсинга. Былоано, что мутация DNMT3A обеспечивает гематологическим злокачественным новообразованием, и что DNMT3A -мутированные клеточные линии проявляют нестабильность транскриптома по сравнению с их изогенными аналоги дикого типа.

Фактически, в раковых клетках фактического сокращения альтернативного сплайсинга по сравнению с нормальными, и типами сплайсинга различаются; например, раковые клетки показывают более высокие уровни удержания интронов, чем нормальные клетки, но более низкие уровни пропуска экзонов. Некоторые различные в сплайсинге раковых клеток связаны с высокими соматическими мутациями в генах факторов сплайсинга, а некоторые из них являются результатом изменений в фосфориании транс-действующих факторов сплайсинга. Другие могут быть вызваны изменением относительного количества произведенных факторов сплайсинга; например, было показано, что клетки рака повышенных уровней сплайсинга SF2 / ASF. Одно исследование показало, что относительно небольшой процент (383 из более чем 26000) альтернативных вариантов сплайсинга был значительно выше в опухолевых клетках, чем в нормальных клетках, что позволяет предположить, что ограниченный набор генов, которые при неправильном сплайсинге вносят вклад в опухоль. развитие. Однако эти вредные эффекты используются с помощью клеточного посттранскрипционного механизма контроля качества, называемого нонсенс-опосредованный распад МРНК [NMD].

Один из конкретных примеров вариант сплайсинга, связанный с раком, находится в одном из генов DNMT человека. Три гена DNMT кодируют ферменты, которые добавляют к ДНК метил группы - модификация, которая часто имеет регуляторные эффекты. Несколько аномально сплайсированных мРНК DNMT3B обнаружены в опухолях и линиях раковых клеток. В двух отдельных исследованиях экспрессия двух из этих аномально сплайсированных мРНК в клетках млекопитающих вызвала изменения в паттернах метилирования ДНК в этих клетках. Клетки с одной из аномальных мРНК также росли в два раза быстрее, чем контрольные клетки, что указывает на прямой этот продукт в развитии опухоли.

Другим примером является Рон (MST1R ) протоонкоген. Важным свойством раковых клеток способность перемещаться и проникать в нормальные ткани. Было обнаружено, что производство ненормально сплайсированного транскрипта, Рон связан с повышенными уровнями SF2 / ASF в клетках рака груди. Аномальная изоформа белка Ron, кодируемого мРНК, приводит к подвижности клеток.

Сверхэкспрессии усеченного варианта сплайсинга гена FOSB - ΔFosB - в конкретных популяции нейронов в прилежащемемре было идентифицировано как причинный механизм, участвующий в индукции и поддержании зависимости от наркотиков и естественного вознаграждения.

Недавние провокационные исследования на указание ключевая функция структуры хроматина и модификаций гистонов в регуляции альтернативного сплайсинга. Эти идеи предположить, что эпигенетическая регуляция определяет не только то, какие генома экспрессируются, но и то, как они сплайсируются.

Общегеномный анализ

Общегеномный анализ альтернативного сплайсинга - сложная задача. Обычно альтернативно сплайсированные транскрипты были обнаружены путем последовательностей EST, но для этого требуется секвенирование очень большого количества EST. Большинство библиотек EST проходят из очень ограниченного числа, поэтому тканеспецифичные варианты сплайсинга, вероятно, будут упущены в любом случае. Были разработаны высокопроизводительные подходы к исследованию сплайсинга, такие как: анализ на основе ДНК-микрочипов, анализы Однако связывания РНК и глубокое секвенирование. Эти методы можно использовать для скрининга, полиморфизмов или мутаций в элементах сплайсинга или вокруг них, которые влияют на связывание с белками. В сочетании с анализми сплайсинга, включая анализы in vivo репортерного гена, можно проанализировать функциональные эффекты полиморфизмов или мутаций на сплайсинг пре-мРНК-транскриптов.

При анализе микрочипов массивы фрагментов ДНК, представляющих отдельные экзоны (например, Affymetrix микромассив экзонов) или границы экзонов / экзонов (например, массивы из или Jivan ). Затем массив исследуют с помощью меченой кДНК из представляющих интерес тканей. КДНК зонда связываются с ДНК из экзонов, включая мРНК в их ткани происхождения или с ДНК из границ, где были соединены два экзона. Это может выявить выявить альтернативно сплайсированных мРНК.

CLIP (перекрестное связывание и иммунопреципитация ) использует УФ-излучение для связывания белков с молекулами РНК в ткани во время сращивание. Затем представляющий интересный транс-действующий регуляторный белок сплайсинга осаждают с использованием специфических антител. Когда РНК, присоединенная к этому белку выделяется и клонируется, она выявляет целевые протеины для этого белка. Другим методом идентификации РНК-связывающих белков и картирования их связывания с транскриптами пре-мРНК является «Оценка геномных аптамеров на микрочипах по сдвигу (MEGAshift)». Net Этот метод включает адаптацию «Систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения» (SELEX) »вместе со считыванием на основе микрочипов. Этот подход также использовался для помощи в определении взаимосвязи между вторичной структурой РНК и связыванием факторов сплайсинга.

Технологии глубокого секвенирования использовались для проведения полногеномного анализа мРНК - необработанных и обработанных. Результаты использования глубокого секвенирования показывают, что у людей примерно 95% транскриптов мультиэксонных проектов подвергаются альтернативному сплайсингу. е-мРНК сплайсируются тканеспецифическим образом. Функциональные геномика и вычислительные подходы, основанные на многократном обучении, также были разработаны для интеграции данных РНК-seq для прогнозирования функций альтернативно соединенных изоформ. Глубокое секвенирование также помогло в обнаружении in vivo переходных процессов, которые высвобождаются во время сплайсинга, определении последовательностей сайтов ветвления и крупномасштабном картировании точек ветвления в транскриптах пре-мРНК человека.

Использование репортера Анализы позволяют найти белки сплайсинга, участвующие в конкретном альтернативном событии сплайсинга, путем конструирования репортерных генов, которые будут экспрессировать один из двух различных флуоресцентных белков в зависимости от происходящей реакции сплайсинга. Этот метод был использован для выделения мутантов, влияющих на сплайсинг, и, таким образом, для идентификации новых регуляторных белков сплайсинга, инактивированных в этих мутантах.

Базы данных

Существует коллекция альтернативных баз данных по сплайсингу. Эти базы данных полезны для поиска генов, имеющих пре-мРНК, которые подвергаются альтернативному сплайсингу и альтернативным событиям сплайсинга.

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

Wikimedia Commons содержит материалы, относящиеся к Альтернативному сращиванию.
Последняя правка сделана 2021-06-11 02:52:51
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте