Направленная эволюция (DE) - это метод, используемый в инженерии белков, который имитирует процесс естественного отбора для направления белков или нуклеиновых кислот к определенной пользователем цели. Он состоит из подвергания гена итеративным циклам мутагенеза (создание библиотеки вариантов), отбора (выражения этих вариантов и выделения членов с желаемой функцией) и амплификации (создания шаблона для следующего раунда). Его можно проводить in vivo (в живых организмах) или in vitro (в клетках или в свободном растворе). Направленная эволюция используется как для белковой инженерии как альтернатива рациональному проектированию модифицированных белков, так и для исследования фундаментальных принципов эволюции в контролируемой лабораторной среде.
Направленная эволюция берет свое начало в 1960-х годах с эволюцией молекул РНК в эксперименте «Монстр Шпигельмана ». Эта концепция была распространена на эволюцию белка через эволюцию бактерий под давлением отбора, который благоприятствовал эволюции одного гена в его геноме.
Ранние методы фагового дисплея в 1980-х годах позволили выявить мутации и селекция на один белок. Это позволило отобрать усиленные связывающие белки, но еще не совместимо с отбором на каталитическую активность ферментов. Методы развития ферментов были разработаны в 1990-х годах и представили эту технику более широкой научной аудитории. Эта область быстро расширилась за счет новых методов создания библиотек вариантов генов и скрининга их активности. В 2018 году разработка методов направленной эволюции была отмечена присуждением Нобелевской премии по химии Фрэнсис Арнольд за эволюцию ферментов и Джорджу Смиту и Грегори Винтер для фагового дисплея.
Направленная эволюция имитирует цикл естественной эволюции в лабораторных условиях. Эволюция требует, чтобы произошли три вещи: вариация между репликаторами, эта вариация вызывает различия в приспособленности, на которые действует отбор, и что эта вариация наследуется. В DE один ген развивается с помощью повторяющихся раундов мутагенеза, отбора или скрининга и амплификации. Раунды этих шагов обычно повторяются, используя лучший вариант из одного раунда в качестве шаблона для следующего, чтобы достичь пошаговых улучшений.
Вероятность успеха в эксперименте направленной эволюции напрямую связана с общим размером библиотеки, поскольку оценка большего количества мутантов увеличивает шансы найти один с желаемыми свойствами.
Первым шагом в выполнении цикла направленной эволюции является создание библиотеки вариантных генов. Пространство последовательностей для случайной последовательности обширно (10 возможных последовательностей для белка из 100 аминокислот) и чрезвычайно редко заполнено функциональными белками. Ни экспериментальная, ни естественная эволюция никогда не сможет приблизиться к выборке такого количества последовательностей. Конечно, естественная эволюция отбирает вариантные последовательности, близкие к функциональным белковым последовательностям, и это имитируется в DE путем мутагенизации уже функционального гена. Некоторые расчеты показывают, что вполне возможно, что для всех практических (то есть функциональных и структурных) целей пространство белковых последовательностей было полностью исследовано в ходе эволюции жизни на Земле.
Исходный ген может быть мутагенезирован случайным образом точечные мутации (химические мутагены или склонность к ошибкам ПЦР ) и вставки и делеции (транспозоны). Генная рекомбинация может имитироваться с помощью Перетасовка ДНК нескольких последовательностей (обычно с идентичностью последовательностей более 70%) для перехода в области пространства последовательностей между перетасованными родительскими генами. Наконец, определенные области гена можно систематически рандомизировать для более целенаправленного подхода, основанного на знании структуры и функций. В зависимости от метода, сгенерированная библиотека будет отличаться долей функциональных вариантов, которые она содержит. Даже если организм используется для экспрессии интересующего гена, путем мутагенизации только этого гена остальная часть генома организма остается прежней и может быть проигнорирована в эволюционном эксперименте (в той степени, в которой обеспечивается постоянная генетическая среда).
Большинство мутаций являются вредными, поэтому библиотеки мутантов, как правило, содержат варианты с пониженной активностью. Следовательно, высокопроизводительный анализ жизненно важен для измерения активности, чтобы найти редкие варианты с полезными мутациями, которые улучшают желаемые свойства. Существуют две основные категории методов выделения функциональных вариантов. Системы отбора напрямую связывают функцию белка с выживанием гена, тогда как системы скрининга индивидуально анализируют каждый вариант и позволяют установить количественный порог для сортировки варианта или популяции вариантов желаемого деятельность. Как отбор, так и скрининг можно проводить на живых клетках (эволюция in vivo) или непосредственно на белке или РНК без каких-либо клеток (эволюция in vitro).
В ходе эволюции in vivo каждая клетка (обычно бактерии или дрожжи ) трансформируется плазмидой, содержащей другой член библиотеки вариантов.. Таким образом, между клетками различается только интересующий ген, а все остальные гены остаются такими же. Клетки экспрессируют белок либо в своей цитоплазме, либо в поверхности, где его функцию можно проверить. Преимущество этого формата заключается в выборе свойств в клеточной среде, что полезно, когда выделенный белок или РНК должны использоваться в живых организмах. При выполнении без клеток DE включает использование трансляции транскрипции in vitro для получения белков или РНК, свободных в растворе или разделенных в искусственных микрокаплях. Этот метод имеет преимущества в том, что он более универсален в условиях отбора (например, температура, растворитель) и может экспрессировать белки, которые были бы токсичными для клеток. Кроме того, эксперименты по эволюции in vitro могут создавать гораздо большие библиотеки (до 10), потому что библиотечная ДНК не должна быть вставлена в клетки (часто это ограничивающий этап).
Выбор для связывающей активности концептуально прост. Целевая молекула иммобилизуется на твердой подложке, по ней протекает библиотека вариантов белков, слабые связывающие вещества смываются, а оставшиеся связанные варианты восстанавливаются для выделения их генов. Связывание фермента с иммобилизованным ковалентным ингибитором также использовалось в качестве попытки выделить активные катализаторы. Этот подход, однако, выбирает только один каталитический оборот и не является хорошей моделью связывания субстрата или истинной реакционной способности субстрата. Если активность фермента может быть сделана необходимой для выживания клеток, либо путем синтеза жизненно важного метаболита, либо путем разрушения токсина, тогда выживаемость клеток зависит от активности фермента. Пропускная способность таких систем обычно ограничена только эффективностью трансформации клеток. Они также менее дороги и трудозатратны, чем скрининг, однако, как правило, их сложно спроектировать, они подвержены артефактам и не дают информации о диапазоне действий, имеющихся в библиотеке.
Альтернативой отбору является система скрининга. Каждый вариантный ген индивидуально экспрессируется и анализируется для количественного измерения активности (чаще всего с помощью цветогенного или флуорогенного продукта). Затем варианты ранжируются, и экспериментатор решает, какие варианты использовать в качестве шаблонов для следующего раунда DE. Даже самые высокопроизводительные анализы обычно имеют меньший охват, чем методы отбора, но дают преимущество получения подробной информации по каждому из проверенных вариантов. Эти дезагрегированные данные могут также использоваться для характеристики распределения деятельности в библиотеках, что невозможно в простых системах отбора. Следовательно, системы скрининга имеют преимущества, когда дело доходит до экспериментальной характеристики адаптивной эволюции и ландшафтов фитнеса.
Когда функциональные белки были выделены, необходимо, чтобы их гены также были выделены, поэтому требуется связь. Это может быть ковалентным, таким как дисплей мРНК, где ген мРНК связан с белком в конце трансляции пуромицином. В качестве альтернативы белок и его ген могут быть совместно локализованы путем компартментализации в живых клетках или каплях эмульсии. Затем выделенные генные последовательности амплифицируют с помощью ПЦР или трансформированными бактериями-хозяевами. В качестве матрицы для следующего раунда мутагенеза можно использовать либо единственную лучшую последовательность, либо пул последовательностей. Повторяющиеся циклы диверсификации-отбора-амплификации генерируют варианты белка, адаптированные к применяемым давлениям отбора.
Рациональный дизайн белка основывается на глубоком знании структуры белка, а также его каталитический механизм. Затем с помощью сайт-направленного мутагенеза вносятся конкретные изменения в попытке изменить функцию белка. Недостатком этого является то, что даже когда структура и механизм действия белка хорошо известны, изменение из-за мутации все еще трудно предсказать. Таким образом, преимущество DE заключается в том, что нет необходимости понимать механизм желаемой активности или то, как мутации могут повлиять на нее.
Ограничение направленной эволюции состоит в том, что Требуется высокопроизводительный анализ, чтобы измерить эффекты большого количества различных случайных мутаций. Это может потребовать обширных исследований и разработок, прежде чем его можно будет использовать для направленной эволюции. Кроме того, такие анализы часто высокоспецифичны для мониторинга конкретной активности и поэтому не могут быть перенесены в новые эксперименты DE.
Кроме того, выбор улучшения исследуемой функции просто приводит к улучшению исследуемой функции. Чтобы понять, как достигаются эти улучшения, необходимо измерить свойства развивающегося фермента. Улучшение исследуемой активности может быть связано с улучшением каталитической активности фермента или концентрации фермента. Также нет гарантии, что улучшение одного субстрата улучшит активность другого. Это особенно важно, когда желаемая активность не может быть непосредственно скринингована или выбрана, и поэтому используется «прокси» субстрат. DE может привести к эволюционной специализации прокси без улучшения желаемой активности. Следовательно, выбор подходящих условий отбора или отбора жизненно важен для успешного DE.
Комбинированные, «полурациональные» подходы исследуются для устранения ограничений как рационального дизайна, так и направленной эволюции.. Полезные мутации редки, поэтому необходимо проверять большое количество случайных мутантов, чтобы найти улучшенные варианты. «Специализированные библиотеки» концентрируются на рандомизации областей, которые, как считается, более богаты полезными мутациями для стадии мутагенеза DE. Сфокусированная библиотека содержит меньше вариантов, чем традиционная библиотека случайного мутагенеза, и поэтому не требует такого высокопроизводительного скрининга.
Создание специализированной библиотеки требует некоторых знаний о том, какие остатки в структуре следует мутировать. Например, знание активного сайта фермента может позволить рандомизировать только остатки, о которых известно, что они взаимодействуют с субстратом. В качестве альтернативы, знание того, какие участки белка вариабельны по природе, может управлять мутагенезом только в этих областях.
Направленная эволюция часто используется для инженерии белков в качестве альтернативы рациональному дизайну, но также может использоваться для исследования фундаментальных вопросов эволюции ферментов.
Как инструмент белковой инженерии, DE был наиболее успешным в трех областях :
Изучение естественной эволюции традиционно основывается на существующих организмах и их генах. Однако исследования фундаментально ограничены отсутствием окаменелостей (и особенно отсутствием последовательностей древней ДНК ) и неполными знаниями о древних условиях окружающей среды. Направленная эволюция исследует эволюцию в контролируемой системе генов для отдельных ферментов, рибозимов и репликаторов (аналогично экспериментальной эволюции эукариоты, прокариоты и вирусы ).
DE позволяет контролировать давление отбора, скорость мутаций и среду (обе абиотической среды, такой как температура, и биотическая среда, такая как другие гены в организме). Кроме того, имеется полная запись всех эволюционных промежуточных генов. Это позволяет проводить подробные измерения эволюционных процессов, например эпистаз, эволюционируемость, адаптивное ограничение ландшафты пригодности и нейтральные сети..
Природный аминокислотный состав протеомов может быть изменен путем глобальных канонических замен аминокислот подходящими неканоническими аналогами в соответствии с экспериментально наложенное селективное давление. Например, глобальные замены природных аминокислот фторированными аналогами в масштабах протеома были предприняты в Escherichia coli и Bacillus subtilis. О полной замене триптофана тиенопиррол-аланином в ответ на 20899 кодонов UGG в Escherichia coli в 2015 году сообщили Будиса и Солл. Ожидается, что экспериментальная эволюция микробных штаммов с четкой аккомодацией дополнительной аминокислоты станет инструментом для экспериментального расширения генетического кода. Направленная эволюция обычно нацелена на конкретный ген для мутагенеза, а затем проверяет полученные варианты на предмет интересующего фенотипа, часто независимо от эффектов приспособленности, тогда как адаптивная лабораторная эволюция выбирает многие геномные мутации, которые способствуют пригодности активно растущих культур.