Войти
Количественное определение вирусов включает подсчет количества вирусов в определенном объеме для определения концентрации вируса. Он используется как в исследованиях и разработках (НИОКР), так и в коммерческих и академических лабораториях, а также в производственных ситуациях, когда количество вируса на различных этапах является важной переменной. Например, производство вирусных вакцин, рекомбинантных белков с использованием вирусных векторов и вирусных антигенов требует количественной оценки вируса для постоянной адаптации и мониторинга процесса с целью оптимизации производительность и реагирование на постоянно меняющиеся требования и приложения. Примеры конкретных случаев, когда необходимо количественно оценить известные вирусы, включают скрининг клонов, оптимизацию множественности инфекции (MOI) и адаптацию методов к культуре клеток. На этой странице обсуждаются различные методы, используемые в настоящее время для количественного определения вирусов в жидких образцах. Эти методы делятся на две категории: традиционные и современные. Традиционные методы - это стандартные в отрасли методы, которые использовались десятилетиями, но, как правило, медленные и трудоемкие. Современные методы представляют собой относительно новые коммерчески доступные продукты и наборы, которые значительно сокращают время количественной оценки. Это не исчерпывающий обзор всех потенциальных методов, а скорее репрезентативное сечение традиционных методов и новых, коммерчески доступных методов. Хотя могут существовать и другие опубликованные методы количественной оценки вирусов, некоммерческие методы здесь не обсуждаются.
Вирусные бляшки Herpes Simplex Вирус Анализы на основе бляшек - это стандартный метод, используемый для определения концентрации вируса с точки зрения инфекционной дозы. Анализы вирусных бляшек определяют количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) в образце вируса, которое является одним из показателей количества вируса. Этот анализ основан на микробиологическом методе, проводимом в чашках Петри или многолуночных планшетах. В частности, конфлюэнтный монослой клеток хозяина инфицирован вирусом в различных разведениях и покрыт полутвердой средой, такой как агар или карбоксиметилцеллюлоза, чтобы предотвратить беспорядочное распространение вирусной инфекции. Вирусная бляшка образуется, когда вирус заражает клетку внутри фиксированного монослоя клеток. Клетка, инфицированная вирусом, будет лизировать и распространять инфекцию на соседние клетки, где цикл от заражения до лизиса повторяется. На инфицированной области клеток образуется бляшка (область инфекции, окруженная неинфицированными клетками), которую можно увидеть в оптический микроскоп или визуально (слить верхнюю среду и добавить раствор кристаллического фиолетового на 15 минут до он окрасил цитоплазму, аккуратно удалив излишки водой, вы увидите неокрашенные места мертвых клеток). Образование налета может занять 3–14 дней, в зависимости от анализируемого вируса. Бляшки обычно подсчитываются вручную, и результаты в сочетании с коэффициентом разбавления, используемым для приготовления планшета, используются для расчета количества бляшкообразующих единиц на единицу объема образца (БОЕ / мл). Результат БОЕ / мл представляет количество инфекционных частиц в образце и основан на предположении, что каждая образовавшаяся бляшка представляет одну инфекционную вирусную частицу.
Клетки, инфицированные ротавирус (вверху) и неинфицированные клетки (внизу) Анализ формирования фокуса (FFA) представляет собой разновидность анализа бляшек, но вместо того, чтобы полагаться на лизис клеток для обнаружения образования бляшек, FFA использует методы иммуноокрашивания с использованием флуоресцентно меченых антител, специфичных к вирусному антигену, для обнаружения инфицированных клеток-хозяев и инфекционных вирусных частиц до того, как образуется фактическая бляшка. FFA особенно полезен для количественной оценки классов вирусов, которые не лизируют клеточные мембраны, поскольку эти вирусы не поддаются анализу на бляшки. Как и в случае анализа бляшек, монослои клеток-хозяев заражаются различными разведениями образца вируса и инкубируются в течение относительно короткого периода инкубации (например, 24–72 часа) в полутвердой наложенной среде, которая ограничивает распространение инфекционного вируса, создавая локализованные скопления (очаги) инфицированных клеток. Затем планшеты зондируют флуоресцентно меченными антителами против вирусного антигена, и для подсчета и количественного определения количества очагов используют флуоресцентную микроскопию. Метод FFA обычно дает результаты за меньшее время, чем анализы бляшек или 50-процентной инфицирующей дозы культуры ткани (TCID 50), но он может быть более дорогим с точки зрения требуемых реагентов и оборудования. Время завершения анализа также зависит от размера области, которую считает пользователь. Большая площадь потребует больше времени, но может обеспечить более точное представление образца. Результаты FFA выражаются в виде фокусообразующих единиц на миллилитр, или FFU / мл.
Пятидесятипроцентная инфекционная доза для культуры ткани (TCID 50) - мера инфекционного вируса титр. Этот анализ конечной точки разведения позволяет количественно определить количество вируса, необходимое для уничтожения 50% инфицированных хозяев или для получения цитопатического эффекта в 50% инокулированных клеток тканевой культуры. Этот анализ может быть более распространен в клинических исследованиях, где необходимо определить летальную дозу вируса или если вирус не образует бляшек. При использовании в контексте культуры ткани клетки-хозяева высевают на чашки и добавляют серийные разведения вируса. После инкубации вручную наблюдают и записывают процент гибели клеток (т.е. инфицированных клеток) для каждого разведения вируса, а результаты используют для математического расчета результата TCID 50. Из-за явных различий в методах и принципах анализа, TCID 50 и БОЕ / мл или другие результаты анализа на инфекционность не эквивалентны. Этот метод может занять до недели из-за времени инфицирования клетки.
Два метода, обычно используемых для расчета TCID 50 (также могут использоваться для расчета других типов конечной точки 50%, например EC50, IC50 и LD50 ):
Теоретическая взаимосвязь между TCID 50 и PFU составляет приблизительно 0,69 PFU = 1 TCID 50 на основе распределения Пуассона, распределения вероятностей, которое описывает, сколько случайных событий (вирусных частиц) происходит с известной средней скоростью (титр вируса), скорее всего, происходит в фиксированном пространстве (количество вирусной среды в лунке). Однако следует подчеркнуть, что на практике эта взаимосвязь может не соблюдаться даже для одной и той же комбинации вирус + клетка, поскольку эти два типа анализа настроены по-разному, а инфекционность вируса очень чувствительна к различным факторам, таким как возраст клеток, наложенные среды, и т. д. Но следующая ссылка определяет взаимосвязь по-разному: предполагая, что используется одна и та же клеточная система, что вирус образует бляшки на этих клетках и что не добавляются никакие процедуры, которые ингибировали бы образование бляшек, ожидается, что 1 мл исходного вируса имеют примерно половину количества бляшкообразующих единиц (БОЕ) как TCID 50. Это только оценка, но основывается на том, что предельное разведение, которое могло бы инфицировать 50% зараженных слоев клеток, часто может первоначально привести к образованию единственной бляшки в инфицированных слоях клеток. В некоторых случаях случайно могут образоваться две или более бляшек, и поэтому фактическое количество PFU следует определять экспериментально.
Математически ожидаемые PFU будут несколько больше, чем половина TCID 50, поскольку отрицательные трубки в TCID 50 представляют собой единицы, образующие нулевой зубной налет, а каждая положительная трубка представляет собой один или несколько блоков, образующих бляшки. Более точная оценка получается применением распределения Пуассона. Где P (o) - это доля отрицательных пробирок, а m - среднее количество инфекционных единиц в объеме (БОЕ / мл), P (o) = e (-m). Для любого титра, выраженного как TCID 50, P (o) = 0,5. Таким образом, e (-m) = 0,5 и m = -ln 0,5, что составляет ~ 0,7.
Следовательно, можно умножить титр TCID 50 (на мл) на 0,7, чтобы предсказать среднее количество БОЕ / мл. При фактическом применении таких расчетов помните, что рассчитанное среднее значение будет действительным только в том случае, если изменения в протоколе, необходимые для визуализации бляшек, не изменят экспрессию инфекционного вируса по сравнению с экспрессией в условиях, используемых для TCID 50.
Таким образом, в качестве рабочей оценки один Можно предположить, что материал с TCID 50 1 × 10 TCID 50 / мл будет производить 0,7 × 10 БОЕ / мл.
(от: ATCC - Преобразование TCID50 в бляшкообразующие единицы PFU-124 )
Существует несколько вариантов количественных анализов на основе белков. методы количественно определяют либо количество всего белка, либо количество определенного вирусного белка в образце, а не количество инфицированных клеток или вирусных частиц. Количественная оценка чаще всего основана на обнаружении флуоресценции. Некоторые варианты анализа позволяют определять количество белка напрямую в образце, в то время как другие варианты требуют инфицирования клетки-хозяина и инкубации для обеспечения роста вируса до количественного определения белка. Используемый вариант зависит в первую очередь от количества белка (т. е. вируса) в исходном образце и чувствительности самого анализа. Если инкубация и необходим рост вируса, перед анализом часто проводят лизис / переваривание клеток и / или вирусов. Большинство методов на основе белков являются относительно быстрыми и чувствительными, но требуют стандартов качества для точной калибровки и количественного определения. fy, а не фактические концентрации вирусных частиц. Ниже приведены конкретные примеры широко используемых анализов на основе белков.
Анализ гемагглютинации (НА) представляет собой обычный нефлуоресцентный количественный анализ белка, специфичный для гриппа. Он основан на том факте, что гемагглютинин, поверхностный белок вирусов гриппа, агглютинирует красные кровяные тельца (то есть заставляет красные кровяные тельца слипаться). В этом анализе разведения образца вируса гриппа инкубируют с 1% -ным раствором эритроцитов в течение одного часа и визуально определяют разведение вируса, при котором происходит первая агглютинация. Анализ дает результат в единицах гемагглютинации (HAU) с типичным отношением БОЕ к HAU в диапазоне 10. Этот анализ занимает ~ 1-2 часа, а результаты могут сильно отличаться в зависимости от технических знаний оператора.
Анализ ингибирования гемагглютинации представляет собой обычный вариант анализа HA, используемый для измерения уровней грипп-специфических антител в сыворотке крови. В этом варианте сывороточные антитела к вирусу гриппа будут препятствовать прикреплению вируса к эритроцитам. Следовательно, гемагглютинация подавляется, когда антитела присутствуют в достаточной концентрации.
Анализ бицинхониновой кислоты (BCA) основан на простом колориметрическое измерение и является наиболее распространенным методом количественного определения белка. BCA аналогичен тестам на белок Lowry или Bradford и впервые был коммерчески доступен компанией Pierce, которая в настоящее время принадлежит Thermo Fisher Scientific. В анализе BCA пептидные связи белка количественно восстанавливают Cu до Cu, что дает светло-голубой цвет. BCA хелатирует Cu в соотношении 2: 1, что приводит к более интенсивно окрашенным частицам, которые поглощаются при 562 нм. Поглощение образца при 562 нм используется для определения основной концентрации белка в образце. Результаты анализа сравнивают с известными стандартными кривыми после анализа на спектрофотометре или планшет-ридере. Общее время анализа составляет от 30 минут до одного часа. Хотя этот анализ является повсеместным и быстрым, ему не хватает специфичности, поскольку он учитывает весь белок, препарат вируса, подлежащий количественной оценке, должен содержать очень низкие уровни белков клетки-хозяина.
Анализ однократной радиальной иммунодиффузии (SRID), также известный как метод Манчини, представляет собой анализ белка, который определяет количество специфического вирусного антигена с помощью иммунодиффузия в полутвердой среде (например, агаре). Среда содержит антисыворотку, специфичную к представляющему интерес антигену, и антиген помещен в центр диска. По мере того, как антиген диффундирует в среду, он создает кольцо осадка, которое растет до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие. Время анализа может составлять от 10 часов до дней в зависимости от времени уравновешивания антигена и антитела. Диаметр зоны от кольца линейно связан с логарифмом концентрации белка и сравнивается с диаметрами зоны для известных стандартов белка для количественного определения. Для этого анализа коммерчески доступны наборы и сыворотки (например, The Binding Site Inc.).
ТЕМ с отрицательным окрашиванием вируса полиомиелита, полоса = 50 нм 
Тканевый участок вирионов нового H1N1 ТЕМ - это специализированный тип микроскопии, который использует пучок электронов, сфокусированный магнитным полем, для изображения образца. ПЭМ обеспечивает визуализацию с пространственным разрешением в 1000 раз больше, чем световой микроскоп (разрешение до 0,2 нм). Требуется ультратонкий отрицательно окрашенный образец. Приготовление образцов включает нанесение образцов на сетку ПЭМ с покрытием и отрицательное окрашивание электронно-непрозрачной жидкостью. Образцы залитых тканей также можно исследовать, если они сделаны тонкими срезами. Подготовка образцов зависит от протокола и пользователя, но обычно требует нескольких часов. ПЭМ-изображения могут отображать отдельные вирусные частицы, а количественный анализ изображений может использоваться для определения концентрации вируса. Эти изображения с высоким разрешением также предоставляют информацию о морфологии частиц, недоступную большинству других методов. Количественные результаты ПЭМ часто бывают лучше, чем результаты других анализов, поскольку все частицы, независимо от инфекционности, количественно определяются в сообщенном результате вирусоподобных частиц на мл (vlp / мл). Количественный ПЭМ обычно хорошо работает для концентраций вируса более 10 частиц / мл. Из-за высокой стоимости инструментов и необходимого количества места и вспомогательного оборудования оборудование ТЕА доступно в ограниченном количестве объектов.
Настраиваемое резистивное импульсное зондирование (TRPS) - это метод, который позволяет проводить высокопроизводительные измерения одиночных частиц отдельных вирусных частиц, поскольку они проходят через регулируемые по размеру нанопоры, по одной за раз. Преимущество метода заключается в одновременном определении размера и концентрации вирусных частиц в растворе с высоким разрешением. Это может быть использовано для оценки стабильности образца и вклада агрегатов, а также общей концентрации вирусных частиц (vp / мл).
Измерение на основе TRPS происходит в ионном буфере, без предварительного окрашивания образцов требуется перед анализом, поэтому метод является более быстрым, чем метод, требующий предварительной обработки флуоресцентными красителями, с общим временем подготовки и измерения менее 10 минут на образец. Анализ вирусов на основе TRPS коммерчески доступен через системы qViro-X, которые могут подвергаться химической дезинфекции путем автоклавирования после проведения измерения.
Хотя большинство проточных цитометров не обладают достаточной чувствительностью, существует несколько коммерчески доступных проточных цитометров, которые можно использовать для количественного определения вирусов. Счетчик вирусов количественно определяет количество интактных вирусных частиц в образце, используя флуоресценцию для обнаружения колокализованных белков и нуклеиновых кислот. Образцы окрашивают двумя красителями, один для белков, а другой для нуклеиновых кислот, и анализируют, когда они проходят через лазерный луч. Количество частиц, вызывающих одновременные события на каждом из двух отдельных каналов флуоресценции, определяется вместе с измеренной скоростью потока пробы для расчета концентрации вирусных частиц (объемных частиц / мл). Результаты обычно по абсолютной величине аналогичны результатам ПЭМ. Анализ имеет линейный рабочий диапазон 10–10 п.о. / мл и время анализа ~ 10 мин с коротким временем подготовки образца.
Диаграмма ELISA Количественная ПЦР использует полимеразную цепную реакцию для амплификации вирусной ДНК или РНК для получения достаточно высоких концентраций для обнаружения и количественного определения по флуоресценции. Как правило, количественная оценка с помощью qPCR основана на серийных разведениях стандартов известной концентрации, анализируемых параллельно с неизвестными образцами для калибровки и сравнения. Количественное обнаружение может быть достигнуто с использованием широкого спектра стратегий обнаружения флуоресценции, включая зонды, специфичные для последовательности, или неспецифические флуоресцентные красители, такие как SYBR Green. Зонды, специфичные для последовательности, такие как TaqMan (разработано Applied Biosystems), Molecular Beacons или Scorpion, связываются только с ДНК соответствующей последовательности, полученной во время реакции. Краситель SYBR Green связывается со всей двухцепочечной ДНК, образующейся в ходе реакции. Хотя SYBR Green прост в использовании, его недостаточная специфичность и низкая чувствительность побуждают большинство лабораторий использовать схемы обнаружения количественной ПЦР на основе зондов. Существует множество вариантов qPCR, включая метод сравнительного порога, который позволяет относительную количественную оценку путем сравнения значений Ct (циклы PCR, которые показывают статистически значимое увеличение продукта) из нескольких образцов, которые включают внутренний стандарт. ПЦР усиливает всю целевую нуклеиновую кислоту, включая те, которые происходят из интактных инфекционных вирусных частиц, из дефектных вирусных частиц, а также свободную нуклеиновую кислоту в растворе. Из-за этого результаты кПЦР (выраженные в количестве копий генома / мл), вероятно, будут выше по количеству, чем результаты ПЭМ. Для количественной оценки вирусов отношение целых вирионов к количеству копий нуклеиновой кислоты редко бывает один к одному. Это связано с тем, что во время репликации вируса нуклеиновая кислота и вирусные белки не всегда продуцируются в соотношении 1: 1, а процесс сборки вируса приводит к образованию полных вирионов, а также пустых капсидов и / или избыточных свободных вирусных геномов. В примере с вирусом ящура отношение целых вирионов к количеству копий РНК в активно реплицирующейся клетке-хозяине составляет приблизительно 1: 1000. Продукты для титрования вирусов на основе количественной ПЦР коммерчески доступны через множество компаний (например, Invitrogen, Roche или Qiagen). Преимущества титрования с помощью кПЦР включают быстрое время обработки (1–4 часа) и чувствительность (позволяет обнаруживать гораздо более низкую концентрацию вирусов, чем другие методы).
ELISA - это более современный вариант анализа белка, в котором используются специфические антитела, связанные с ферментом, для обнаружения присутствия неизвестного количества антигена ( т.е. вирус) в образце. Событие связывания антитело-антиген выявляется и / или количественно определяется по способности фермента преобразовывать реагент в обнаруживаемый сигнал, который можно использовать для расчета концентрации антигена в образце. Пероксидаза хрена (HRP) является обычным ферментом, используемым в схемах ELISA из-за его способности усиливать сигнал и повышать чувствительность анализа. Существует много разновидностей или типов анализов ELISA, но в целом их можно классифицировать как непрямой, конкурентный, сэндвич или обратный. Наборы для ELISA коммерчески доступны от множества компаний, и количественная оценка обычно проводится с помощью хромогенных репортеров или флуоресценции (например, Invitrogen, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Этот метод намного менее трудоемок, чем традиционные методы, и может занять от 4 до 24 часов в зависимости от времени инкубации антител.
