Войти
Анализ белка Брэдфорда был разработан Мэрион М. Брэдфорд в 1976 году. Это быстрая и точная спектроскопическая аналитическая процедура, используемая для измерения концентрации белка в растворе. Реакция зависит от аминокислотного состава измеряемых белков.
Рис. 1. Кумасси бриллиантовый синий G-250, связывающий краситель для метода Брэдфорда 
Цветная реакция белка и реагента Брэдфорда Анализ Брэдфорда, a колориметрический анализ протеина основан на сдвиге оптической плотности красителя кумасси бриллиантовый синий G-250. Краситель Coomassie Brilliant Blue G-250 существует в трех формах: анионной (синий), нейтральной (зеленый) и катионной (красный). В кислых условиях красная форма красителя превращается в синюю форму, связываясь с исследуемым белком. Если нет белка для связывания, раствор останется коричневым. Краситель образует прочный нековалентный комплекс с карбоксильной группой белка за счет силы Ван-дер-Ваальса и аминогруппой за счет электростатических взаимодействий. Во время образования этого комплекса красная форма красителя кумасси сначала отдает свой свободный электрон ионизируемым группам белка, что вызывает нарушение нативного состояния белка и, как следствие, обнажает его гидрофобные карманы. Эти карманы в третичной структуре белка нековалентно связываются с неполярной областью красителя посредством первого взаимодействия связей (силы Ван-дер-Ваальса ), которые позиционируют положительные аминогруппы в близость с отрицательным зарядом красителя. Связь дополнительно усиливается за счет второго взаимодействия связи между ними, ионного взаимодействия. Связывание белка стабилизирует синюю форму красителя Кумасси; таким образом, количество комплекса, присутствующего в растворе, является мерой концентрации белка и может быть оценено с помощью измерения оптической плотности.
катионная (несвязанная) форма имеет зеленый / красный цвет и имеет максимум спектра поглощения, исторически считавшийся равным 465 нм. Анионная связанная форма красителя, которая удерживается вместе за счет гидрофобных и ионных взаимодействий, имеет максимум спектра поглощения, исторически считавшийся равным 595 нм. Увеличение поглощения при 595 нм пропорционально количеству связанного красителя и, следовательно, количеству (концентрации) белка, присутствующего в образце.
В отличие от других анализов белка, анализ белка Брэдфорда менее подвержен влиянию вмешательство различных химических соединений, таких как натрий, калий или даже углеводов, таких как сахароза, которые могут присутствовать в образцах белка. Исключением являются повышенные концентрации моющего средства. Додецилсульфат (SDS), распространенный детергент, можно найти в экстрактах белков, поскольку он используется для лизиса клеток путем разрушения липидного бислоя мембраны и денатурирования белков для SDS-PAGE. В то время как другие детергенты мешают анализу при высокой концентрации, вмешательство, вызванное SDS, бывает двух разных режимов, и каждый происходит при разной концентрации. Когда концентрации SDS ниже критической концентрации мицелл (известной как CMC, от 0,00333% мас. / Об. До 0,0667%) в растворе красителя кумасси, детергент имеет тенденцию прочно связываться с белком, ингибируя сайты связывания белка для краситель реагент. Это может вызвать недооценку концентрации белка в растворе. Когда концентрации SDS выше CMC, детергент прочно связывается с зеленой формой красителя Кумасси, вызывая смещение равновесия, тем самым производя больше синей формы. Это вызывает увеличение поглощения при 595 нм независимо от присутствия белка.
Другие помехи могут возникать из-за буфера, используемого при приготовлении образца белка. Высокая концентрация буфера приведет к завышению концентрации белка из-за истощения свободных протонов из раствора конъюгированным основанием из буфера. Это не будет проблемой, если используется низкая концентрация белка (впоследствии буфер).
Для измерения оптической плотности бесцветного соединения необходимо провести анализ Брэдфорда. Некоторые бесцветные соединения, такие как белки, могут быть определены количественно при оптической плотности 280 нм из-за присутствия ароматических колец, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин, но если ни одна из этих аминокислот отсутствует, абсорбция не может быть измерена при 280 нм.
Многие белковые растворы имеют самое высокое поглощение при 280 нм в спектрофотометре в УФ-диапазоне. Для этого требуются спектрофотометры, способные выполнять измерения в УФ-диапазоне, чего многие не могут. Кроме того, максимум поглощения при 280 нм требует, чтобы белки содержали ароматические аминокислоты, такие как тирозин (Y), фенилаланин (F) и / или триптофан (W). Не все белки содержат эти аминокислоты, что может исказить измерения концентрации. Если в образце присутствуют нуклеиновые кислоты, они также будут поглощать свет с длиной волны 280 нм, что еще больше искажает результаты. Используя анализ белка Брэдфорда, можно избежать всех этих осложнений, просто смешав образцы белка с красителем Coomassie Brilliant Blue G-250 (реагент Брэдфорда) и измерив их оптическую плотность при 595 нм, что в видимом диапазоне.
Процедура анализа белка Брэдфорда очень проста и проста в выполнении. Это делается за один этап, когда реагент Брэдфорда добавляется в пробирку вместе с образцом. После тщательного перемешивания смесь почти сразу приобретает синий цвет. Когда краситель связывается с белками в процессе, который занимает около 2 минут, происходит изменение максимума поглощения красителя с 465 нм до 595 нм в кислых растворах. Этот краситель создает прочные нековалентные связи с белками посредством электростатических взаимодействий с амино- и карбоксильными группами, а также взаимодействий Ван-дер-Ваальса. Только молекулы, которые связываются с белками в растворе, демонстрируют это изменение абсорбции, что устраняет опасения, что несвязанные молекулы красителя могут вносить вклад в экспериментально полученное значение абсорбции. Этот процесс более выгоден, поскольку он менее дорог, чем другие методы, прост в использовании и имеет высокую чувствительность красителя к белку.
Через 5 минут инкубации оптическую плотность можно определить при 595 нм с помощью спектрофотометр ; легкодоступная машина.
Этот анализ является одним из самых быстрых анализов белков. Общее время, необходимое для настройки и завершения анализа, составляет менее 30 минут. Весь эксперимент проводится при комнатной температуре.
Анализ белка Брэдфорда позволяет измерять количество белка от 1 до 20 мкг. Это чрезвычайно чувствительный метод.
Краситель представляет собой стабильный готовый к использованию продукт, приготовленный в фосфорной кислоте. Он может оставаться при комнатной температуре до 2 недель, прежде чем он начнет разлагаться.
Образцы белка обычно содержат соли, растворители, буферы, консерванты, восстановители и хелатирующие агенты с металлами. Эти молекулы часто используются для солюбилизации и стабилизации белков. Другие анализы белка, такие как BCA и Lowry, неэффективны, потому что молекулы, такие как восстановители, мешают анализу. Использование Брэдфорда может быть выгодным по сравнению с этими молекулами, поскольку они совместимы друг с другом и не будут мешать.
Линейный график, полученный в результате анализа (поглощение в зависимости от концентрации белка в мкг / мл), можно легко экстраполировать для определения концентрация белков по наклону линии.
Это чувствительный метод. Это тоже очень просто: измерить OD при 595 нм после 5 минут инкубации. В этом методе также можно использовать спектрофотометр Vis.
Анализ Брэдфорда является линейным в коротком диапазоне, обычно от 0 мкг / мл до 2000 мкг / мл, часто делая разведения до перед анализом необходим образец. При выполнении этих разведений ошибка одного разведения усугубляется при последующих разведениях, что приводит к линейной зависимости, которая не всегда может быть точной.
Основные условия и детергенты, такие как SDS, могут влиять на способность красителя связываться с белком через его боковые цепи. Однако есть некоторые реагенты Брэдфорда, совместимые с моющими средствами. Анализ Брэдфорда зависит от последовательности белка. Таким образом, если белок не содержит идеального количества ароматических остатков, краситель не сможет эффективно связываться с белком. Еще один недостаток анализа протеина Брэдфорда состоит в том, что этот метод зависит от сравнения поглощения белка с поглощением стандартного белка. Если белок не реагирует на краситель так же, как стандартный белок, возможно, измеренная концентрация будет неточной.
Реагенты в этом методе имеют тенденцию окрашивать пробирки. Использовать одни и те же пробирки нельзя, поскольку пятно может повлиять на показания оптической плотности. Этот метод также чувствителен ко времени. Когда тестируется более одного раствора, важно убедиться, что каждый образец инкубируется в течение одного и того же времени для точного сравнения.
Это также подавляется присутствием детергентов, хотя эту проблему можно решить. путем добавления циклодекстринов к смеси для анализа.
Большая часть нелинейности проистекает из равновесия между двумя различными формами красителя, которое нарушается добавлением белка. Анализ Брэдфорда линеаризует, измеряя отношение оптической плотности 595 на 450 нм. Этот модифицированный анализ Брэдфорда примерно в 10 раз более чувствителен, чем традиционный.
Краситель кумасси синий G250, используемый для связывания с белками в исходном методе Брэдфорда, легко связывается с группами белков аргинина и лизина. Это недостаток, потому что предпочтение красителя связываться с этими аминокислотами может приводить к различному ответу анализа между разными белками. Для исправления этого отклонения были внесены изменения в исходный метод, такие как увеличение pH путем добавления NaOH или добавления красителя. Хотя эти модификации приводят к менее чувствительному анализу, модифицированный метод становится чувствительным к детергентам, которые могут влиять на образец.
Таким образом, чтобы найти стандартную кривую, необходимо использовать различные концентрации BSA (бычий Альбумин сыворотки), чтобы построить стандартную кривую с концентрацией, нанесенной на ось x, и поглощением, нанесенной на ось y. Используется только узкая концентрация BSA (2-10 мкг / мл) для создания точной стандартной кривой. Использование широкого диапазона концентраций белка затруднит определение концентрации неизвестного белка. Затем эта стандартная кривая используется для определения концентрации неизвестного белка. Далее подробно описывается, как перейти от стандартной кривой к концентрации неизвестного.
Сначала добавьте линию наилучшего соответствия или Линейная регрессия и отобразите уравнение на диаграмме. В идеале значение R должно быть как можно ближе к 1. R представляет собой сумму квадратов значений соответствия, вычтенных из каждой точки данных. Поэтому, если R намного меньше единицы, подумайте о повторении эксперимента, чтобы получить более надежные данные.
График 1. Фактические данные BSA, полученные с помощью микромасштабного спектрофотометра UV-Vis Уравнение, отображаемое на диаграмме, дает средство для расчета оптической плотности и, следовательно, концентрации неизвестных образцов. На графике 1 x - это концентрация, а y - оптическая плотность, поэтому необходимо перестроить уравнение, чтобы найти x и ввести оптическую плотность измеренного неизвестного. Вполне вероятно, что значения оптической плотности неизвестного вещества будут выходить за пределы диапазона стандарта. Эти расчеты не должны включаться, поскольку данное уравнение не может применяться к числам за пределами его ограничений. В крупном масштабе необходимо вычислить коэффициент экстинкции, используя закон Бера-Ламберта A = εLC, в котором A - измеренная оптическая плотность, ε - наклон стандартной кривой, L - длина кюветы., C - определяемая концентрация. В микромасштабе кювета не может использоваться, и поэтому нужно только перегруппировать, чтобы найти x.
Таблица 1. Фактические данные анализа для определения концентрации неизвестного вещества на основе линии наилучшего соответствия приведенной выше стандартной кривой Для достижения концентрации, которая имеет смысл с данными, разведениями, концентрациями и единицами измерения unknown необходимо нормализовать (Таблица 1). Для этого необходимо разделить концентрацию белка на объем, чтобы нормализовать концентрацию, и умножить на количество разбавленного, чтобы скорректировать любое разбавление, сделанное в белке перед проведением анализа.
Альтернативные анализы протеина включают:
