Войти
NUMT, произносится как «новая мощь», является акронимом сегмента «ядерной митохондриальной ДНК», придуманным эволюционным генетиком, Jose V. Lopez, в котором описывается транспозиция любого типа цитоплазматической митохондриальной ДНК в ядерный геном эукариот организмов.
Все больше и больше последовательностей NUMT с разным размером и длины, в разнообразном числе эукариот, были обнаружены по мере накопления большего полногеномного секвенирования различных организмов. Фактически, NUMT часто непреднамеренно обнаруживаются исследователями, которые искали мтДНК (митохондриальная ДНК ). NUMT были обнаружены у всех изученных эукариот, и почти все участки митохондриального генома могут быть интегрированы в ядерный геном. Однако NUMT различаются по количеству и размеру у разных видов. Такие различия могут быть объяснены межвидовой изменчивостью таких факторов, как стабильность зародышевой линии и количество митохондрий. После высвобождения мтДНК в цитоплазму из-за митохондриальных изменений и морфологических изменений мтДНК переносится в ядро одним из различных предсказанных методов. и в конечном итоге вставляются процессами репарации двухцепочечных разрывов в ядерную ДНК (яДНК). Была обнаружена не только какая-либо корреляция между долей некодирующей ДНК и численностью NUMT в геноме, но также доказано, что NUMT имеют неслучайное распределение и более высокую вероятность встраивания в определенное место генома по сравнению с другими. В зависимости от местоположения вставки NUMT могут нарушать функцию генов. Кроме того, De novo интеграция псевдогенов NUMT в ядерный геном в некоторых случаях имеет неблагоприятный эффект, вызывая различные расстройства и старение.
Первое применение термина NUMT в примере домашней кошки (Felis catus) было Поразительно, поскольку количество и содержание митохондриальных генов были амплифицированы в 38-76 раз в ядерном геноме кошки, помимо транспонирования из цитоплазмы. Последовательности кошачьих NUMT, по-видимому, не функционируют из-за обнаружения множественных мутаций, различий в митохондриальном и ядерном генетическом коде и очевидной вставки в обычно инертные области центромеры. Наличие фрагментов NUMT в геноме не является проблемой для всех видов; например, показано, что последовательности митохондриального происхождения способствуют репликации ядерной ДНК в Saccharomyces cerevisiae. Хотя расширенная транслокация фрагментов мтДНК и их совместная амплификация со свободной митохондриальной ДНК были проблематичными при диагностике митохондриальных нарушений, изучении популяционной генетики и филогенетическом анализе, ученые использовали NUMT в качестве генетические маркеры для определения относительной скорости ядерных и митохондриальных мутаций и воссоздания эволюционного дерева.
Согласно теории эндосимбиоза, получившее признание примерно в 1970-х годах, митохондрия, как основная энергетическая фабрика клетки, ранее была свободноживущим прокариотом, вторгшимся в эукариотическую клетку. Согласно этой теории, симбиотические органеллы постепенно переносили свои гены в геном эукариот, подразумевая, что мтДНК постепенно интегрировалась в ядерный геном. Несмотря на метаболические изменения и функциональные адаптации у эукариот-хозяев, кольцевая митохондриальная ДНК содержится в органеллах. Митохондриальная ДНК, содержащая 37 генов, играет важную роль в производстве необходимых соединений, таких как необходимые ферменты для правильного функционирования митохондрий. В частности, было высказано предположение, что определенные гены (такие как гены для субъединиц I и II цитохромоксидазы) внутри органеллы необходимы для регулирования окислительно-восстановительного баланса во всех связанных с мембраной цепях переноса электронов. Сообщалось, что эти части митохондриального генома используются наиболее часто. Митохондрии - не единственное место, в котором можно найти мтДНК клетки, митохондриальную ДНК; иногда может происходить перенос митохондриальной ДНК из органелл в ядро; доказательство такой транслокации было обнаружено путем сравнения последовательности митохондриальной ДНК с последовательностью генома аналогов. Интеграция и рекомбинация цитоплазматической мтДНК в ядерную ДНК называется ядерной митохондриальной ДНК, которая сокращенно обозначается как NUMT. Возможное присутствие ДНК органелл внутри ядерного генома было предположено после обнаружения гомологичной структуры митохондриальной ДНК, что произошло вскоре после открытия в 1967 году наличия независимой ДНК внутри органелл. Эта тема осталась нетронутой до 1980-х годов. Первоначальное свидетельство того, что ДНК может перемещаться между клеточными компартментами, появилось, когда в митохондриальном геноме кукурузы были обнаружены фрагменты ДНК хлоропластов с помощью перекрестной гибридизации между ДНК хлоропластов и митохондрий и физического картирования гомологичных областей. После этого первоначального наблюдения Эллис придумал название «беспорядочная ДНК», чтобы обозначить внутриклеточный перенос ДНК от одной органеллы к другой и наличие ДНК органелл во многих клеточных компартментах. Это не только важное открытие само по себе, но также очень информативное и полезное для понимания эволюционного процесса и временного периода, в котором могут иметь место различные события. Поиск мтДНК в ядерной ДНК продолжался до 1994 года, когда было сообщено о недавней замечательной транспозиции 7,9 т.п.н. митохондриального генома размером обычно 17,0 т.п.н. в конкретное положение ядерной хромосомы у домашней кошки. Это время, когда NUMT был придуман для обозначения больших участков митохондриальной ДНК в геноме. К настоящему времени были секвенированы полные геномы многих эукариот, как позвоночных, и беспозвоночных, и обнаружен NUMT в ядерном геноме различных организмов, включая дрожжи, Podospora, морской еж, саранча, медоносная пчела, Tribolium, крыса, кукуруза, рис и приматы. У Plasmodium, комаров NUMT Anopheles gambiae и Aedes aegypti практически невозможно обнаружить. Напротив, консервативные фрагменты NUMT в настоящее время были идентифицированы в данных генома для Ciona Кишечник, Neurospora crassa, Schizosaccharomyces pombe, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster и Rattus norvegicus. Антунес и Рамос впервые обнаружили присутствие NUMT в геноме рыб в 2005 году с использованием BLAST N, MAFFT, очень тщательного картирования генома и филогенного анализа. Во всем животном мире Apis mellifera из филума Arthropoda и Hydra magnipapillata из филума Cnidaria являются соответственно первым и вторым животных с самым высоким отношением NUMT к общему размеру ядерного генома, тогда как Monodelphis Domestica, или серый короткохвостый опоссум, является рекордсменом по частоте NUMT среди позвоночных. Подобно животным, NUMT в изобилии присутствуют в растениях, и сообщалось о самом длинном фрагменте NUMT, известном до сих пор, о частично дублированной вставке мтДНК размером 367 т.п.н. размером 367 т.п.н. Arabidopsis thaliana.
Встраивание NUMT в ядерный геном и его сохранение в ядерном геноме инициируется физической доставкой митохондриальной ДНК в ядро. За этим этапом следует интеграция мтДНК в геном посредством механизма негомологичного соединения концов во время процесса репарации двухцепочечного разрыва (DSB), как предполагалось при изучении пекарских дрожжей Saccharomyces Cerevisiae; и завершается внутригеномной динамикой амплификации, мутации или делеции, которые также известны как модификации после вставки. Механизм переноса мтДНК в ядро до конца не изучен.
Различные пути перемещения мтДНК в ядро Перенос высвобожденной мтДНК в ядро: Первым шагом в процессе переноса является высвобождение мтДНК в цитоплазму. Торснесс и Фокс продемонстрировали скорость перемещения мтДНК из митохондрий в ядро, используя штамм дрожжей ura3- с сконструированной плазмидой URA3 , необходимым геном для биосинтеза урацила, в митохондриях. Во время размножения таких штаммов дрожжей, несущих ядерную мутацию ura3, плазмидная ДНК, которая ускользает из митохондрии в ядро, дополняет дефект биосинтеза урацила, восстанавливая рост в отсутствие урацила и легко оценивая фенотип. Скорость переноса ДНК из митохондрий в ядро оценивалась как 2 x 10-5 на клетку на поколение, в то время как, напротив, в случае мутанта cox2 скорость переноса плазмиды из ядра в митохондрии, по-видимому, составляет минимум в 100000 раз меньше. Многие факторы контролируют скорость выхода мтДНК из митохондрий в ядро. Более высокая частота мутаций мтДНК по сравнению с яДНК в клетках многих организмов является важным фактором, способствующим переносу митохондриальных генов в ядерный геном. Одним из межгенных факторов, приводящих к более высокой скорости разрушения митохондриальных макромолекул, включая мтДНК, является наличие высокого уровня активных форм кислорода (АФК), образующихся в митохондриях в качестве побочных продуктов в механизме синтеза АТФ.. Некоторые другие факторы, влияющие на выход мтДНК из митохондрий, включают действие мутагенных агентов и другие формы клеточного стресса, которые могут повредить митохондрии или их мембраны, что доказывает, что можно предположить, что экзогенные повреждающие агенты (ионизирующее излучение и химические генотоксические агенты) увеличивают скорость выхода мтДНК в цитоплазму. Торснесс и Фокс продолжили свои исследования, чтобы найти эндогенные факторы, влияющие на выход мтДНК в ядро. Они выделили и изучили 21 ядерный мутант с различными комбинациями мутаций по крайней мере в 12 ядерных локусах, называемых мутациями yme (дрожжевое ускользание из митохондрий), в различных условиях окружающей среды, поскольку некоторые из этих мутаций вызывают температурную чувствительность. Они обнаружили эти мутации, которые нарушают функции митохондрий из-за изменения продуктов генов, влияют на целостность митохондрий и приводят к утечке мтДНК в цитоплазму. Кроме того, дефекты белков изменяют скорость переноса мтДНК в ядро. Например, в случае мутанта yme1 аномальные митохондрии нацелены на деградацию вакуоли с помощью pep4, основной протеиназы, и деградация увеличивает выход мтДНК в ядро в процессе митофагии. Кроме того, Торснесс и Кэмпбелл обнаружили, что при разрушении pep4 частота выхода мтДНК в штаммах yme1 снижается. Точно так же нарушение PRC1, который кодирует карбоксипептидазу Y, снижает скорость ускользания мтДНК у дрожжей yme1. Фактические данные показывают, что митофагия является одним из возможных способов переноса мтДНК в ядро и до сих пор считается наиболее поддерживаемым путем. Некоторые другие возможные пути показаны на рисунке 1. Первый путь, как было объяснено, представляет собой мутант yme1, который приводит к инактивации белка YMe1p, локализованной в митохондриях АТФ-зависимой металлопротеиназы, что приводит к высокой скорости ускользания. мтДНК в ядро. Митохондрии штамма yme1 подвергаются деградации вакуоли чаще, чем штамм дикого типа. Более того, цитологические исследования предложили несколько других возможных путей у разнообразного числа видов, включая лизис митохондриального компартмента, прямую физическую связь и слияние мембран между митохондриями и ядро, а также инкапсуляция митохондриальных компартментов внутри ядра, как показано на рисунке 1.
Различные возможные способы обработки мтДНК перед вставкой в яДНК Подготовка перед вставкой: После достижения ядра мтДНК должен войти в ядерный геном. Ожидается, что скорость включения мтДНК в ядерный геном будет зависеть от количества DSB в яДНК, активности систем репарации DSB и скорости выхода мтДНК из органелл. Вставка мтДНК включает три основных процесса, показанных на рисунке 2; во-первых, мтДНК должна иметь правильную форму и последовательность; другими словами, мтДНК должна быть отредактирована, что приведет к появлению нового редактируемого сайта в полинуклеотидной структуре. Митохондриальная ДНК не универсальна, и у животных, похожих на растения, редактирование митохондрий показывает очень беспорядочные закономерности появления таксонов. Как показано на рисунке 2, существует три возможных способа подготовки мтДНК для встраивания в ядерную ДНК. Процесс в основном зависит от времени, в течение которого мтДНК переходит в ядро. Как показано на рисунке 2b, прямая интеграция неотредактированных фрагментов мтДНК в ядерные геномы является наиболее вероятной, и доказательства были обнаружены как у растений, так и у генома арабидопсиса и животных с помощью различных методов, включая анализ на основе BLAST. В этом случае мтДНК переносится в ядро, в результате чего редактирование и интроны возникают в митохондрии позже. Если ген, например, был перенесен в ядро в одной ветви до того, как эволюционировало редактирование митохондрий, но остался в органелле в других линиях, где возникло редактирование, ядерная копия была бы больше похожа на отредактированный транскрипт, чем на оставшиеся митохондриальные копии на редактируемые сайты. Другая представленная и менее поддерживаемая модель, рис. 2а, - это модель, опосредованная кДНК, в которой содержащаяся в интроне мтДНК входит в ядро и путем обратной транскрипции сплайсированного и отредактированного митохондриального транскрипта интегрируется в яДНК. Третий предложенный механизм - это прямой перенос и интеграция безинтронной мтДНК в ядро, рисунок 2c, посредством чего редактирование и интроны в митохондриях приходят и уходят в процессе эволюции. В этом случае введение и удаление интрона, а также обратная транскрипция происходит внутри митохондрий, и конечный продукт, отредактированная безинтронная мтДНК, будет интегрироваться в яДНК после переноса в ядро.
Механизм встраивания NUMT в ядерную ДНК Встраивание в ядерный геном: После завершения подготовительного этапа мтДНК готова для встраивания в ядерный геном. Основываясь на сайте интеграции NUMT и проанализированных результатах эксперимента с пекарскими дрожжами, Бланшар и Шмидт предположили, что мтДНК вставляется в двухцепочечный разрыв (DSB) посредством негомологичного механизма соединения концов. Гипотеза получила широкое признание. Более поздние анализы подтвердили участие NHEJ в интеграции NUMT у людей. Эти процессы происходят как в соматических клетках, так и в клетках зародышевой линии. У животных и людей, однако, способность репарации DSB в клетках зародышевой линии зависит от оогенетической и сперматогенетической стадии, тем не менее, из-за низкой репарационной активности зрелые сперматозоиды неспособны к репарации DSB. Кроме того, DSB также может быть восстановлен с помощью гомологичной рекомбинации (HR), которая является более точной и вносит меньше ошибок в процесс восстановления, хотя еще не наблюдалась в процессе вставки мтДНК; Помимо канонического NHEJ, DSB репарируются с помощью механизма, который включает последовательности, содержащие несколько гомологичных нуклеотидов на концах DSB, подлежащих лигированию. Этот механизм известен как опосредованное микрогомологией соединение концов, сокращенно MMEJ. MMEJ представляет собой наиболее мутагенный DSB механизм репарации из-за образования делеций, вставок различных размеров и других перестроек генома у млекопитающих. Как показано на рисунке 3, процессы вставки мтДНК и репарации DSB включают несколько этапов, которые включают выравнивание сегментов ДНК, обработку концов ДНК, синтез ДНК и лигирование. На каждом этапе требуются определенные белковые комплексы, чтобы способствовать возникновению указанных событий. Как показано на рисунке 3, в NHEJ, гетеродимер Ku70 / Ku80 и ДНК-зависимая протеинкиназа (ДНК-PK), для объединения концов ДНК-фрагментов, нуклеаза Artemis и полинуклеотид киназа 3 'фосфатаза (PNKP), для конечного процессинга, ДНК-полимеразы семейства X (Pol μ и Pol λ) и терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT), для синтеза ДНК и комплекс XLF / XRCC4 / LigIV для завершения репарации и соединения концов через фосфодиэфирную связь - это белковые комплексы, участвующие в процессе репарации DSB у многих высших организмов. ДНК-полимеразы (Pol μ и Pol λ) и комплекс XLF / XRCC4 / LigIV используются двумя механизмами репарации NHEJ и MMEJ и несут одинаковую ответственность в обоих процессах репарации. Первый этап MMEJ выполняется белковыми комплексами WRN, Artemis, ДНК-PK и XRCC4, которые обрабатывают концы DSB и фрагментов мтДНК в дополнение к их выравниванию, чтобы полимеразы и лигазы могли завершить вставку NUMT (рисунок 3).
Модификация после вставки: Сложный паттерн NUMT по сравнению с одним митохондриальным фрагментом, появление прерывистой митохондриальной ДНК в ядерном геноме и, возможно, разная ориентация этих фрагментов, свидетельствуют -процессы внедрения NUMT в ядерный геном. Причина появления этих сложных шаблонов может быть результатом множественных вставок NUMT в горячих точках вставки. Кроме того, дублирование после вставки способствует разнообразию NUMT. NUMT не имеют механизма самовоспроизводства или механизма транспозиции; следовательно, дупликация NUMT, как ожидается, будет происходить в тандеме или включать более крупную сегментарную дупликацию со скоростью, репрезентативной для остальной части генома. Доказательства дупликаций NUMT, которые не находятся в непосредственной близости от других NUMT, присутствуют во многих геномах и, вероятно, происходят как часть сегментарной дупликации. Однако дупликации недавних специфичных для человека NUMT как часть сегментарной дупликации кажутся редкими; У людей обнаружено, что только несколько NUMT перекрываются с сегментной дупликацией, и эти NUMT были обнаружены только в одной из копий, но отсутствовали в других, что ясно демонстрирует, что NUMT были вставлены после событий дублирования. Удаление - это еще один метод модификации NUMT после вставки, который еще не изучался с той же степенью детализации, что и вставка. Постоянная эрозия филогенных сигналов и высокая частота мутаций в мтДНК животных затрудняют распознавание такой модификации, особенно делеции. Изучение случаев, в которых паттерн присутствие-отсутствие NUMT не согласуется с филогенетическим деревом, должно сделать возможным обнаружение недавних потерь NUMT с помощью использования множественных выравниваний генома с присутствием внешней группы. Бенсассон и члены его команды использовали этот метод для оценки самого старого введенного NUMT у человека, который датируется примерно 58 миллионами лет назад.
Как количество митохондрий и их функциональный уровень отличается у разных эукариотических организмов, длина, структура и последовательность NUMT сильно различаются. Исследователи обнаружили, что недавние вставки NUMT происходят из различных сегментов митохондриального генома, включая D-петлю и, в некоторых крайних случаях, ряд почти полноразмерных митохондриальных геномов. Последовательность, частота, распределение по размерам и даже трудности нахождения этих последовательностей в геноме существенно различаются у разных видов. Большинство фрагментов ДНК, перенесенных из митохондрий и пластид в ядерный геном, имеют размер менее 1 т.п.н. Тем не менее, в геномах некоторых растений обнаружены чрезвычайно большие фрагменты ДНК органелл.
Поскольку геном развивается и изменяется с течением времени в результате мутаций, количество NUMT в геноме меняется в ходе эволюции. NUMT входит в ядро и вставляется в яДНК на разных этапах времени. Из-за постоянной мутации и нестабильности NUMT сходство этого участка генома с мтДНК широко варьируется в масштабах царства Animalia и даже в пределах определенного генома. Например, последнее количество NUMT, зарегистрированное в геноме человека, составляет 755 фрагментов, размер которых варьируется от 39 п.н. до почти всей митохондриальной последовательности. Существует 33 паралогичных последовательности с более чем 80% сходством последовательностей и длиной более 500 п.н. Более того, не все фрагменты NUMT в геноме являются результатом миграции мтДНК; некоторые являются результатом амплификации после вставки. Было обнаружено, что старые NUMT более распространены в геноме человека, чем недавние интегранты, что указывает на то, что мтДНК может быть амплифицирована после вставки. Dayama et al. разработал новый высокопроизводительный метод точного определения количества NUMT в геноме человека, названный dinumt. Этот метод позволяет ей и членам ее команды идентифицировать вставки NUMT любого размера во всех геномах, секвенированных с использованием технологии парного секвенирования с большей чувствительностью. Они применили dinumt к 999 людям из 1000 Genomes Project и Human Genome Diversity Project (HGDP) и провели обновленный анализ обогащения у людей с использованием этих полиморфных вставок. Дальнейшее исследование и генотипирование обнаруженного NUMT также анализируют возраст вставки, происхождение и характеристики последовательности. Наконец, они оценили их потенциальное влияние на продолжающиеся исследования митохондриальной гетероплазмии.
Как упоминалось ранее, мтДНК вставляется в ядерный геном только тогда, когда DSB продуцируется эндогенными или экзогенными повреждающими факторами. Однако мтДНК не вставляется ни в одном месте генома. Более того, нет корреляции между долей некодирующей ДНК и численностью NUMT; Кроме того, Антунес и Рамос обнаружили, что старые NUMT вставляются преимущественно в известные и предсказанные локусы, как это предполагалось для недавних NUMT в геноме человека, во время их активной работы над последовательностью NUMT у рыб с использованием метода анализа BLASTN. Таким образом, на основании этих исследований обнаружено, что введение NUMT в ядерный геном неслучайно. Одно из лучших исследований, доказывающих неслучайное распределение и включение NUMT в ядерный геном, выполнено Цуджи и его товарищами по команде. Используя метод LAST вместо BLAST, который делает возможным вычисление E-значения с более высокой точностью и не недооценивает повторяющиеся элементы на флангах NUMT, Цуджи и его товарищ по команде смогли точно охарактеризовать место вставки NUMT. Они обнаружили, что фрагменты NUMT имеют тенденцию вставляться в области с высокой локальной кривизной или гибкостью ДНК и олигомерами с высоким содержанием A + T, особенно TAT. Более того, NUMT в основном вставляются в открытые области хроматина. Используя тот же метод, Цуджи показал, что NUMT обычно не группируются вместе, а NUMT, производимые D-петлей, обычно недостаточно представлены, что более ярко проявляется у обезьян и людей по сравнению с крысами и мышами из-за общей длины их NUMT. Однако Цуджи также обнаружил, что структура ретротранспозона сильно обогащена на флангах NUMT и большинство NUMT вставлены в непосредственной близости от ретротранспозона, в то время как только несколько, 10 из 557 NUMT, были вставлены в ретротранспозон, они не смогли найти любая четкая взаимосвязь между размером некодирующей ДНК и количеством NUMT.
NUMT не являются полностью бесполезными, и с ними связаны определенные функции. Хотя вставка NUMT ранее считалась бесполезными псевдогенами, недавние человеческие NUMT оказались потенциально мутагенным процессом, который может нарушить функциональную целостность генома человека. Накопление мутации в NUMT, постинсерционное изменение, мутагенный механизм инсерции NUMT, MMEJ и NHEJ, DSB, а также место, в котором находится вставка горячая точка, могут вызвать мутацию и драматические изменения структура генома в сайте интеграции, вмешивается в функцию генома и оказывает существенное влияние на выражение генетической информации. Более того, интеграция последовательностей мтДНК существенно влияет на пространственную организацию яДНК и может играть важную роль в эволюции эукариотических геномов. В дополнение к отрицательному эффекту мтДНК, те консервативные старые NUMT в геноме, вероятно, представляют собой эволюционный успех, и их следует рассматривать как потенциальный эволюционный механизм для усиления областей геномного кодирования. Более того, Chatre и Ricchetti с использованием двумерного гель-электрофореза, плазмидной конструкции, мутагенеза, в силликоанализе ACS мотивов, и анализ скорости потери плазмид показал, что мигрирующие митохондриальные ДНК могут влиять на репликацию ядерной области, в которую они вставлены. Благодаря своим функциональным данным они показали, что последовательности митохондриального происхождения способствуют репликации яДНК в Saccharomyces cerevisiae. NUMT представляют собой богатую консенсусную последовательность из 11 п.н. ARS core-A (ACS), присутствие которой в совпадениях с этими согласованными мотивами в ориджине репликации Saccharomyces cerevisiae необходимо, но не достаточно для функции начало репликации и любые мутации в этом консенсусе вызывают снижение или потерю активности репликации ДНК. Учитывая высокую плотность мотивов ACS, некоторые NUMT появляются по существу как носители ACS. Напротив, эффективность репликации выше у тех штаммов дрожжей, которые имеют плазмиды, содержащие как NUMT, так и ARS. Они также обнаружили, что некоторые NUMT могут работать как независимая репликационная вилка, а поздние источники хромосом, а NUMT, расположенные рядом с ARS или внутри них, обеспечивают ключевые элементы последовательности для репликации. Таким образом, NUMT могут действовать как независимые источники при вставке в соответствующий геномный контекст или влиять на эффективность ранее существовавших источников.
Заболевания и расстройства: Вставка NUMT в геном может быть проблематичной. Транспозиция NUMT в геном также была связана с заболеваниями человека. Интеграция de novo псевдогенов NUMT в ядерный геном в некоторых случаях оказывает неблагоприятное воздействие, вызывая различные расстройства и старение. Интеграция мтДНК в кодирующие гены в клетках зародышевой линии имеет драматические последствия для развития эмбриона и во многих случаях является летальной. Несколько псевдогенов NUMT, связанных с заболеваниями, обнаруживаются внутри экзонов или на границах экзон-интрон генов человека. Например, пациенты с синдромом муколипидоза наследуют мутацию, вызванную вставкой фрагмента митохондриального ND5 размером 93 п.н. в экзон 2 гена муколипина R403C. Это первый случай наследственного заболевания из-за вставки NUMT. Несмотря на небольшую группу лечения, трансплантация стволовых клеток оказалась эффективной, и уровни лизосомальных ферментов, по-видимому, нормализовались после трансплантации по крайней мере в одном случае. Синдром Паллистера – Холла, нарушение развития, в другом примере, где функциональное нарушение ключевого гена развития возникает в результате de novo вставки 72 пн. Фрагмент мтДНК в GLI3 экзон 14 в хромосоме 7, что приводит к центральной и постаксиальной полидактилии, раздвоению надгортанника, неперфорированному анусу, почечным аномалиям, включая кистозные мальформации, почечная гипоплазия, эктопическая имплантация мочеточника и легочная сегментация аномалии, такие как двусторонние двулопастные легкие. Мутация сайта сплайсинга в человеческом гене фактора VII плазмы, которая вызывает тяжелый дефицит фактора VII в плазме, кровотечение, является результатом вставки NUMT длиной 251 п.н. В качестве последнего известного примера, вставка из 36 п.н. в экзон 9 гена USH1C, связанная с синдромом Ушера типа IC, представляет собой NUMT. Определенного проклятия для синдрома Ашера пока не обнаружено, однако в настоящее время проводится клиническое исследование с участием 18 добровольцев, чтобы определить влияние UshStat как в краткосрочном, так и в долгосрочном периоде. Это исследование было начато в сентябре 2013 г. и планируется завершить к октябрю 2023 г.
Старение: Несколько исследований показали, что появление de novo псевдогенов NUMT в геноме соматических клеток может иметь этиологическое важность для канцерогенеза и старения. Чтобы показать связь между старением и NUMT в ядерном геноме, Ченг и Ивесса использовали мутантные штаммы yme1-1 Saccharomyces Cerevisiae, которые имеют более высокую скорость миграции мтДНК. Метод точно такой же, как метод Торснесса и Фокса, который использовали для определения важных механизмов и факторов миграции мтДНК в ядро. Они обнаружили, что штаммы дрожжей с повышенной скоростью миграции фрагментов мтДНК в ядро демонстрируют ускоренное хронологическое старение, тогда как штаммы со сниженной скоростью переноса мтДНК в ядро демонстрируют увеличенную CLS, хронологическую продолжительность жизни, что, возможно, может быть связано с эффектом NUMT. на ядерных процессах, включая репликацию ДНК, рекомбинацию и репарацию, а также на транскрипцию генов. Влияние NUMT на высшие эукариотические организмы было исследовано Каро и его товарищами по команде на крысах в качестве модельного организма. Используя количественную оценку ПЦР в реальном времени, гибридизацию мтДНК с яДНК in situ и сравнение молодых и старых крыс, Каро и его команда не только смогли определить высокую концентрацию цитохромоксидазы III и 16S рРНК из мтДНК как у молодых, так и у старых крыс, но они также могли обнаружить увеличение количества митохондриальных последовательностей в яДНК по мере взросления крысы. Таким образом, основываясь на этих выводах, митохондрии могут быть основным триггером старения, но конечной мишенью также может быть ядро.
Рак: Наиболее ужасное влияние вставки NUMT происходит, когда мтДНК вставляется в регуляторную области или ядерных структурных генов и нарушает или изменяет жизненно важные клеточные процессы. Например, при первичных новообразованиях головного мозга низкой степени злокачественности флуоресцентный анализ гибридизации in situ помог распознать мтДНК, локализованную в ядре, в корреляции с общим увеличением содержания мтДНК в клетке. Это онтогенетически раннее событие важно в этиологии этих опухолей. Аналогичным образом, в клетках гепатомы последовательности мтДНК присутствуют в ядерном геноме с более высоким числом копий по сравнению с нормальными тканями. Другим примером может быть яДНК HeLa, которая содержит последовательности, которые гибридизуются с фрагментами мтДНК размером приблизительно 5 т.п.н. Анализ показал, что яДНК злокачественных клеток содержит последовательности генов митохондриальной цитохромоксидазы I, ND4, ND4L и 12S рРНК. На основании этих выводов предполагалось, что фрагменты мтДНК действуют как мобильный генетический элемент в инициации канцерогенеза. Саузерн-блоттинг - это метод, используемый для определения частоты встраивания митохондрий в яДНК нормальные и опухолевые клетки мышей и крыс, что доказало, что последовательности мтДНК гораздо более многочисленны и многочисленны в яДНК опухолевых клеток грызунов по сравнению с нормальными клетками. Используя зонды FISH, ПЦР и секвенирование данных, картирование и сравнение, Джу и его товарищ по команде обнаружили, что слияние митохондриально-ядерного генома происходит с той же скоростью на пару оснований ДНК, что и межхромосомные ядерные перестройки, что указывает на наличие высокой частоты контакта между митохондриальная и ядерная ДНК в некоторых соматических клетках. Кроме того, Джу и его товарищи по команде исследовали время интеграции соматической мтДНК в ядерный геном, оценивая случаи, в которых метастатический образец был секвенирован в дополнение к первичной опухоли. В некоторых случаях перенос мтДНК в ядро в соматических клетках очень частый и может происходить после образования неопластов и в ходе субклональной эволюции рака, что позволяет предположить, что это событие происходит в клонах общих предковых раковых клеток или в нормальных соматических клетках до возникновения новообразование. Эти данные продемонстрировали наличие прямой корреляции между NUMT и раком в разных органах тела. Понимание взаимосвязи, времени вставки NUMT, местоположения вставки и нарушенных генов поможет в создании более мощного и эффективного лекарства.
Хотя понимание неслучайного вставка NUMT и выполнение определенной функции после вставки помогает выявить структуру и определить полную функцию генома, особенно генома человека, NUMT использовались в качестве экспериментальных инструментов и были полезны в различных биологических областях еще до получения каких-либо знаний о функция ЧИСЛОВ. Например, NUMT можно использовать не только как генетические маркеры, но и как инструмент для понимания относительной скорости мутаций в ядре и митохондриях, а также для воссоздания эволюционных деревьев. Продолжающийся процесс интеграции NUMT в ядерный геном подтверждается обнаружением NUMT, которые были вставлены в геном человека после дивергенции человека и шимпанзе. Некоторые из этих NUMT изменчивы в отношении присутствия или отсутствия в геноме, что указывает на то, что они только недавно возникли в человеческой популяции, что позволяет использовать их в качестве генетических маркеров происхождения. Используя протокол, основанный на выравнивании генома, для оценки количества NUMT у близкородственных видов, Хазкани-Ково и Граур смогли не только идентифицировать эволюционные события, которые могли повлиять на состав NUMT в каждом геноме, но также смогли восстановить состав NUMT у общего предка человек и шимпанзе. NUMT также можно использовать для сравнения скорости эволюции нефункциональной ядерной последовательности с таковой функциональной мтДНК и определения скорости эволюции по скорости накопления мутаций вдоль последовательностей NUMT с течением времени. Наименее избирательно ограниченные области - это сегменты с наибольшим отклонением от митохондриальной последовательности. Одним из наиболее многообещающих приложений исследования NUMT является его использование для изучения ядерных мутаций. В многоквартирных домах NUMT считаются нефункциональными. Следовательно, ядерные мутации можно отличить от митохондриальных изменений, и станет возможным изучение нуклеотидных замен, вставок и делеций. Кроме того, гомология паралогичных последовательностей NUMT с мтДНК позволяет тестировать влияние локальной последовательности на мутации. Вся эта информация, полученная в результате изучения фрагментов NUMT, может быть использована для понимания эволюции митохондрий, а также эволюционных процессов на протяжении всей истории.
NUMT дают возможность изучить древнее разнообразие митохондриальных линий и обнаружить доисторическую межвидовую гибридизацию. Древняя гибридизация была впервые обнаружена (с использованием NUMT) у щетинохвостов, затем у обезьян-колобинов и, совсем недавно, у прямого предка человека. Гибридизация гоминидов произошла примерно во времена человека / шимпанзе / горилла разлука. Это последнее исследование касается человека NUMT, совместно используемого с шимпанзе и гориллой. Совместная филогения трех последовательностей NUMT и митохондриальных геномов человекообразных обезьян подразумевает, что общий предок трех NUMT был передан в линию человека / шимпанзе / гориллы от вида гоминидов, отделенного от них примерно 4,5 миллионами лет эволюции мтДНК. Хотя гибридизация такого масштаба не является чем-то необычным среди приматов, ее появление в прямой линии человеческого происхождения примерно в критическое время видообразования человека и обезьяны является поразительным результатом. Дополнительные NUMT с похожей филогенетикой указывают на то, что такие события могут быть не уникальными.
Другая проблема возникла из-за присутствия NUMT в геноме, связанного с трудностями определения точного количества митохондриальных вставок в яДНК. Определение точного количества псевдогенов NUMT для вида является сложной задачей по нескольким причинам. Одной из причин, затрудняющих обнаружение последовательностей NUMT, является изменение этих последовательностей путем мутации и делеции. Еще два существенных препятствия очень затрудняют распознавание NUMT; Во-первых, это отсутствие корреляции между долей некодирующей яДНК и количеством вставок NUMT в ядерном геноме. То есть вставка NUMT может происходить в известной или предсказанной кодирующей области, как в интроне, так и в экзоне, а не только в межгенной и интронной области. Во-вторых, митохондриальная ДНК, интегрированная в ядерные геномы животных, в первую очередь ограничена животными с кольцевыми митохондриальными геномами без интронов. Исследования NUMT недоступны на животных с линейными митохондриальными геномами или с интрон-содержащими митохондриями. Таким образом, несмотря на все доступные передовые технологии, еще предстоит определить, существуют ли различия в транспозиции NUMT между кольцевыми и линейными мтДНК.
Использование секвенирования по Сэнгеру для определения места вставки NUMT в ядерном геноме Эти трудности для обнаружения присутствия NUMT может быть проблематичным. Транслоцированные митохондриальные последовательности в ядерном геноме имеют потенциал для амплификации в дополнение или даже вместо аутентичной последовательности мтДНК-мишени, что может серьезно затруднить популяционный генетический и филогенетический анализ, поскольку мтДНК широко использовалась для картирования популяций, эволюционных и филогенетических исследований, видовая идентификация по штрих-коду ДНК, диагностика различных патологий, судебная медицина. Эта одновременная амплификация NUMT со свободной внехромосомной мтДНК, кроме того, не позволяет определить точное количество фрагментов NUMT в геноме различных организмов, таких как комары Aedes aegypti, особенно те, у которых происходит расширенная транслокация фрагментов мтДНК. Это затрудняет диагностику некоторых митохондриальных нарушений. Например, большой псевдоген NUMT был обнаружен на хромосоме 1, тогда как более недавний анализ той же последовательности привел к выводу, что мтДНК сперматозоидов имеет мутации, которые вызывают низкую подвижность сперматозоидов. Другим примером может служить недавний отчет, описывающий гетероплазматическую молекулу мтДНК, содержащую пять связанных миссенс-мутаций, распределенных по смежным генам мтДНК CO1 и CO2 у пациентов болезнью Альцгеймера, однако, более поздние исследования с использованием ПЦР, анализа вариантов сайта рестрикционной эндонуклеазы и филогенетического анализа показали, что ядерные последовательности CO1 и CO2 показали, что они расходились с современными мтДНК человека на ранних этапах эволюции гоминидов около 770 тысяч лет назад, и эти сохранившиеся NUMT могли вызвать болезнь Альцгеймера. Одним из возможных способов предотвращения такого ошибочного результата является амплификация и сравнение гетерогенной последовательности, содержащей как мтДНК, так и яДНК, с полученными результатами секвенирования очищенной и обогащенной мтДНК по Сэнгеру, как показано на рисунке 4. Хотя этот метод прост и требуется всего несколько праймеров, это предотвратит существенную ошибку в филогенетических исследованиях популяции и все ранее упомянутые ложные результаты.
