Войти
A Нокаут гена (аббревиатура: KO ) - это генетический метод, при котором один из генов организма становится неработоспособным («выбивается» из организма). Однако КО может также относиться к гену, который отключен, или к организму, несущему этот ген. Нокаутные организмы или просто нокауты используются для изучения функции генов, обычно путем исследования эффекта потери генов. Исследователи делают выводы из разницы между организмом с нокаутом и нормальными людьми.
Методика KO по существу противоположна нокауту гена. Одновременный нокаут двух генов в организме известен как двойной нокаут (DKO ). Точно так же термины тройной нокаут (TKO ) и четверной нокаут (QKO ) используются для описания трех или четырех нокаутных генов соответственно.. Однако необходимо различать гетерозиготные и гомозиготные КО. В первом случае выбивается только одна из двух копий гена (аллели ), а во втором - оба.
Knockout выполняются через разнообразные техники. Первоначально были идентифицированы встречающиеся в природе мутации, а затем необходимо было установить потерю или инактивацию генов с помощью секвенирования ДНК или других методов.
Лабораторная мышь, у которой ген, влияющий на рост волос, был отключен (слева), показан рядом с нормальной лабораторной мышью. Традиционно гомологичная рекомбинация была основным методом, вызывающим нокаут гена. Этот метод включает создание конструкции ДНК, содержащей желаемую мутацию. Для целей нокаута это обычно включает маркер устойчивости к лекарственному средству вместо желаемого гена нокаута. Конструкция также будет содержать минимум 2 т.п.н. гомологии с целевой последовательностью. Конструкция может быть доставлена в стволовые клетки либо посредством микроинъекции, либо электропорации. Затем этот метод полагается на собственные механизмы восстановления клетки для рекомбинации конструкции ДНК в существующую ДНК. Это приводит к изменению последовательности гена, и в большинстве случаев ген будет транслироваться в нефункциональный белок, если он вообще транслируется. Однако это неэффективный процесс, поскольку на гомологичную рекомбинацию приходится только 10-10 интеграций ДНК. Часто маркер выбора лекарственного средства на конструкции используется для отбора клеток, в которых произошло событие рекомбинации.
Дикий тип Physcomitrella и нокаутные мхи : отклоняющиеся фенотипы, индуцированные в трансформантах библиотеки с нарушением генов. Physcomitrella дикого типа и трансформированные растения выращивали на минимальной среде Knop для индукции дифференцировки и развития гаметофора. Для каждого растения показаны обзор (верхний ряд; масштабная полоса соответствует 1 мм) и крупный план (нижний ряд; масштабная полоса равна 0,5 мм). A: Гаплоидный мох дикого типа, полностью покрытый лиственными гаметофорами, и крупный план листа дикого типа. B – D: Различные мутанты. Эти стволовые клетки, в которых сейчас отсутствует ген, можно было бы использовать in vivo, например, у мышей, вставляя их в ранние эмбрионы. Если полученная химерная мышь содержала генетическое изменение в своей зародышевой линии, это могло быть передано потомству.
В диплоидных организмах, которые содержат два аллеля для большинства генов, и может также содержать несколько связанных генов, которые сотрудничают в одной и той же роли, дополнительные раунды трансформации и отбора выполняются до тех пор, пока каждый целевой ген не будет выбит. Селективное разведение может потребоваться для получения гомозиготных животных с нокаутом.
Рис. 1. Мутация сдвига рамки считывания в результате делеции одной пары оснований, вызывающая изменение аминокислотной последовательности и преждевременного стоп-кодона. В настоящее время используются три метода, которые включают точное нацеливание последовательность ДНК, чтобы ввести двухцепочечный разрыв. Как только это происходит, механизмы репарации клетки будут пытаться восстановить этот двухцепочечный разрыв, часто посредством негомологичного соединения концов (NHEJ), которое включает прямое лигирование двух отрезанных концов вместе. Это может быть сделано несовершенно, поэтому иногда возникают вставки или делеции пар оснований, которые вызывают мутации сдвига рамки. Эти мутации могут сделать ген, в котором они происходят, нефункциональным, что приведет к нокауту этого гена. Этот процесс более эффективен, чем гомологичная рекомбинация, и поэтому его легче использовать для создания двуаллельных нокаутов.
Нуклеазы цинковых пальцев состоят из ДНК-связывающих доменов, которые могут точно нацеливаться на Последовательность ДНК. Каждый цинковый палец может распознавать кодоны желаемой последовательности ДНК и, следовательно, может быть модульно собран для связывания с конкретной последовательностью. Эти связывающие домены связаны с эндонуклеазой рестрикции, которая может вызывать двухцепочечный разрыв (DSB) в ДНК. Процессы восстановления могут привести к мутациям, нарушающим функциональность гена.
Эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN ), также содержат ДНК-связывающий домен и нуклеазу, которая может расщеплять ДНК. Область связывания ДНК состоит из аминокислотных повторов, каждый из которых распознает одну пару оснований желаемой целевой последовательности ДНК. Если это расщепление нацелено на кодирующую область гена, и опосредованная NHEJ репарация приводит к вставкам и делециям, часто возникает мутация сдвига рамки считывания, нарушая, таким образом, функцию гена.
Кластерный короткие палиндромные повторы с регулярными интервалами (CRISPR ) / Cas9 - это метод редактирования генома, который содержит направляющую РНК в комплексе с белком Cas9. Направляющая РНК может быть сконструирована так, чтобы соответствовать желаемой последовательности ДНК посредством простого комплементарного спаривания оснований, в отличие от трудоемкой сборки конструкций, необходимой для «цинковых пальцев» или TALEN. Спаренный Cas9 вызовет двухцепочечный разрыв ДНК. Следуя тому же принципу, что и цинковые пальцы и TALEN, попытки восстановить эти двухцепочечные разрывы часто приводят к мутациям сдвига рамки считывания, которые приводят к нефункциональному гену.
Gene knockin похож на ген нокаут, но он заменяет один ген другим вместо его удаления.
Условные нокауты гена допускают делецию гена в ткани в зависимости от времени. Это требуется вместо нокаута гена, если нулевая мутация приведет к гибели эмбриона. Это делается путем введения коротких последовательностей, называемых сайтами loxP, вокруг гена. Эти последовательности будут введены в зародышевую линию посредством того же механизма, что и нокаут. Затем эту зародышевую линию можно скрестить с другой зародышевой линией, содержащей Cre-рекомбиназу, которая представляет собой вирусный фермент, который может распознавать эти последовательности, рекомбинировать их и удаляет ген, фланкированный этими сайтами.
A нокаутную мышь (слева), которая является моделью ожирения по сравнению с нормальной мышью. Нокауты в основном используются для понимания роли определенного гена или ДНК путем сравнения нокаутного организма с диким типом с аналогичным фоном.
Нокаут организмы также используются в качестве скрининговых инструментов при разработке лекарств для нацеливания на конкретные биологические процессы или недостатки с помощью определенного нокаута или понять механизм действия лекарственного средства с помощью библиотеки нокаута организмы, охватывающие весь геном, например, в Saccharomyces cerevisiae.
