Войти
В молекулярном клонировании и биологии, а (или вставка гена ) относится к методу генной инженерии, который включает замену информации последовательности ДНК в генетическом локусе один-к-одному или вставку последовательности информация не найдена в локусе. Как правило, это делается на мышах, поскольку технология для этого процесса более усовершенствована, и существует высокая степень сложности общих последовательностей между мышами и людьми. Разница между технологией "нокдаун" и традиционными трансгенными методами состоит в том, что нокаут включает ген, вставленный в конкретный локус, и, таким образом, представляет собой "нацеленную" инсерцию. Это противоположно нокауту гена..
Обычно технология нокаута используется для создания моделей заболеваний. Это метод, с помощью которого научные исследователи могут изучать функцию регуляторного аппарата (например, промоторов ), который регулирует экспрессию заменяемого природного гена. Это достигается путем наблюдения за новым фенотипом рассматриваемого организма. В этом случае используются BAC и YAC, чтобы можно было передавать большие фрагменты.
Нокаут генов возник как небольшая модификация оригинальной техники нокаута, разработанной Мартином Эвансом, Оливером Смитисом и Марио Капеччи. Традиционно, методы «нокаута» основывались на гомологичной рекомбинации для обеспечения целевой замены гена, хотя были разработаны другие методы, использующие опосредованную транспозоном систему для вставки целевого гена. Примером этого является использование фланкирующих участков loxP, которые вырезаются при экспрессии рекомбиназы Cre с помощью генных векторов. Эмбриональные стволовые клетки с интересующей модификацией затем имплантируются в жизнеспособную бластоцисту, которая вырастет в зрелую химерную мышь с некоторыми клетками, имеющими генетическую информацию исходных клеток бластоцисты, и другими клетками, имеющими модификации, введенные в эмбриональные стволовые клетки. Последующее потомство химерной мыши будет иметь ген "нок-ин".
"нокаут" гена впервые позволил провести основанные на гипотезах исследования модификаций генов и полученных фенотипов. Мутации в гене р53 человека, например, могут быть вызваны воздействием бензо (а) пирена (BaP), а мутированная копия гена р53 может быть вставлена в геномы мыши. Опухоли легких, наблюдаемые у мышей с «нокаутом», подтверждают гипотезу о канцерогенности BaP. Более поздние разработки в технике «нокаута» позволили свиньям иметь ген зеленого флуоресцентного белка, вставленный с помощью системы CRISPR / Cas9, что позволяет гораздо более точно и успешно вставлять гены. Скорость включения CRISPR / Cas9-опосредованного гена также позволяет генерировать двуаллельные модификации некоторых генов и фенотип у мышей, наблюдаемый в одном поколении, в беспрецедентные сроки.
Технология нокаута отличается от технологии нокаута тем, что технология нокаута направлена либо на удаление части последовательности ДНК, либо на вставку нерелевантной информации о последовательности ДНК для нарушения экспрессии определенного генетического локуса. С другой стороны, технология вставки генов изменяет интересующий генетический локус посредством замены информации о последовательности ДНК один на один или путем добавления информации о последовательности, которая не обнаруживается в указанном генетическом локусе. Следовательно, нокаут гена можно рассматривать как усиление функциональной мутации, а нокаут гена - как потерю функциональной мутации, но нокаут гена может также включать замену функционального локуса гена на мутантный фенотип, что приводит к некоторой потере функции.
Благодаря успеху методов подстановки генов на данный момент можно предвидеть множество клинических применений. Уже было показано, что введение участков гена иммуноглобулина человека в мышей позволяет им продуцировать гуманизированные антитела, которые являются терапевтически полезными. Должна быть возможна модификация стволовых клеток у людей для восстановления функции целевого гена в определенных тканях, например, возможно, исправление мутантного гена гамма-цепи рецептора IL-2 в гемопоэтическом стволе. клетки для восстановления развития лимфоцитов у людей с Х-сцепленным тяжелым комбинированным иммунодефицитом.
В то время как технология подстановки генов оказалась мощным методом для создания моделей болезней человека и понимания в белки in vivo, все еще существуют многочисленные ограничения. Многие из них совпадают с ограничениями технологии нокаута. Во-первых, комбинации нокаут-генов приводят к усложнению взаимодействий, которые встроенные гены и их продукты имеют с другими участками генома, и, следовательно, могут приводить к большему количеству побочных эффектов и трудно объяснимых фенотипов. Кроме того, только несколько локусов, таких как локус ROSA26, были охарактеризованы достаточно хорошо, чтобы их можно было использовать для условных нокаутов генов; создание комбинаций репортера и трансгенов в одном локусе проблематично. Самым большим недостатком использования нокаута гена для создания модели заболевания человека является то, что физиология мыши не идентична физиологии человека, и человеческие ортологи белков, экспрессируемых у мышей, часто не полностью отражают роль гена в патология человека. Это можно увидеть на мышах, продуцируемых с мутацией фиброза ΔF508 в гене CFTR, который составляет более 70% мутаций в этом гене в человеческой популяции и приводит к кистозной болезни. фиброз. Хотя мыши ΔF508 CF действительно демонстрируют дефекты обработки, характерные для мутации человека, они не проявляют легочных патофизиологических изменений, наблюдаемых у людей, и практически не несут легочного фенотипа. Подобные проблемы можно решить с помощью различных моделей животных, а модели свиней (легкие свиньи имеют много биохимических и физиологических сходств с легкими человека) были созданы в попытке лучше объяснить активность мутации ΔF508.
