Войти
Условный нокаут гена - это метод, используемый для устранения определенного гена в определенной ткани, например в печени. Этот метод полезен для изучения роли отдельных генов в живых организмах. Он отличается от традиционного нокаута гена, потому что он нацелен на определенные гены в определенное время, а не удаляется с начала жизни. Использование техники условного нокаута гена устраняет многие побочные эффекты от традиционного нокаута гена. При традиционном нокауте гена может произойти гибель эмбриона в результате мутации гена, и это мешает ученым изучать ген у взрослых. Некоторые ткани нельзя изучать отдельно, поэтому ген должен быть неактивным в одной ткани, оставаясь активным в других. С помощью этой технологии ученые могут нокаутировать гены на определенной стадии развития и изучать, как нокаут гена в одной ткани влияет на тот же ген в других тканях.
Схема, показывающая, как создать мышь с условным нокаутом: мышь, содержащую ген Cre, и мышь, содержащую ген lox, были скрещены для создания условного нокаут для конкретного интересующего гена. Мыши в природе не экспрессируют сайты Cre-рекомбиназы или lox, но они были сконструированы для экспрессии этих генных продуктов для создания желаемого потомства. Наиболее часто используемой техникой является система рекомбинации Cre-lox. Фермент Cre-рекомбиназа специфически распознает два сайта lox (локусы рекомбинации) в ДНК и вызывает рекомбинацию между ними. Во время рекомбинации две нити ДНК обмениваются информацией. Эта рекомбинация вызовет делецию или инверсию генов между двумя сайтами lox, в зависимости от их ориентации. Целый ген можно удалить, чтобы отключить его. Вся эта система является индуцируемой, поэтому можно добавить химическое вещество, чтобы выключить гены в определенное время. Двумя наиболее часто используемыми химическими веществами являются тетрациклин, который активирует транскрипцию гена рекомбиназы Cre, и тамоксифен, который активирует транспорт белка рекомбиназы Cre к ядру. Лишь несколько типов клеток экспрессируют Cre-рекомбиназу, и никакие клетки млекопитающих не экспрессируют ее, поэтому нет риска случайной активации lox-сайтов при использовании условного нокаута гена у млекопитающих. Выяснение того, как экспрессировать Cre-рекомбиназу в организме, обычно является наиболее сложной частью этого метода.
Метод условного нокаута гена часто используется для моделирования заболеваний человека у других млекопитающих.. Это расширило возможности ученых по изучению болезней, таких как рак, которые развиваются в определенных типах клеток или на стадиях развития. Известно, что мутации в гене BRCA1 связаны с раком груди. Ученые использовали условный нокаут гена для удаления аллеля BRCA1 в ткани молочной железы у мышей и обнаружили, что он играет важную роль в подавлении опухоли.
Специфический ген в мозге мыши, который, как предполагалось, был вовлечен в начало болезни Альцгеймера, кодирующей фермент циклин-зависимую киназу 5 (Cdk5), был нокаутирован. Было обнаружено, что такие мыши «умнее» обычных мышей и способны справляться со сложными задачами более разумно по сравнению с «нормальными» мышами, выведенными в лаборатории.
Условные нокауты генов у мышей часто используются для изучения болезней человека, поскольку многие гены производят сходные фенотипы у обоих видов. В течение последних 100 лет для этого использовалась генетика лабораторных мышей, потому что мыши - это млекопитающие, которые физиологически достаточно похожи на людей, чтобы проводить качественные исследования. У этих двух генов такие схожие гены, что из 4000 изученных генов только 10 были обнаружены у одного вида, но не у другого. Все млекопитающие имели одного общего предка примерно 80 миллионов лет назад; технически говоря, все геномы млекопитающих сравнительно похожи. Однако при сравнении мышей и людей их кодирующие белки участки геномов идентичны на 85% и имеют сходство между 99% их гомологов. Это сходство приводит к тому, что у двух видов проявляются сходные фенотипы. [8] [12] Их гены очень похожи на человеческие, причем 99% гомологов похожи. Наряду с производством сходных фенотипов, они также являются очень многообещающими кандидатами для условного нокаута генов [8]. Цель KOMP - создать нокаутные мутации в эмбриональных стволовых клетках для каждого из 20 000 генов, кодирующих белок, у мышей. Гены выбиты, потому что это лучший способ изучить их функции и узнать больше об их роли в заболеваниях человека. Существуют две основные стратегии условного нокаута гена: нацеливание на гены или гомологичная рекомбинация и захват гена. В обоих методах обычно используется модифицированный вирусный вектор или линейный фрагмент в качестве способа транспортировки искусственной ДНК в ES-клетку-мишень. Затем клетки растут в чашке Петри в течение нескольких дней и вставляются в зародыши на ранних стадиях. Наконец, эмбрионы помещаются в матку взрослой самки, где она может вырасти в свое потомство [9]. Некоторые аллели в этом проекте не могут быть выбиты традиционными методами и требуют специфичности техники условного нокаута гена. Для нокаута последних оставшихся аллелей необходимы другие комбинаторные методы. Условный нокаут гена - процедура, требующая много времени, и существуют дополнительные проекты, направленные на нокаут оставшихся генов мыши. Участник проекта KOMP, Оливер Смитис, возможно, внес наибольший научный вклад в нацеливание на этот ген. Оливер получил Нобелевскую премию по медицине за метод, позволяющий идентифицировать функции в генах, и как использовать метод «нокаута» для удаления определенных генов. К сожалению, пионер в области генной ориентации умер 10 января 2017 года в возрасте 91 года [11]. Проект КОМП был начат в 2006 году и продолжается до сих пор. Репозиторий КОМП стимулирует участников проектов возвращать им отзывы, а тем, кто соответствует определенным критериям, может быть возмещено 50% стоимости их исследовательских ячеек. [10]
8. Остин, С. П., Бэтти, Дж. Ф., Брэдли, А., Букан, М., Капеччи, М., Коллинз, Ф. С., Дав, В. Ф., Дуйк, Г., Даймеки, С., Эппиг, Д. Т., Гридер, Ф. Б., Хайнц, Н., Хикс, Г., Инсел, Т. Р., Джойнер, А., Коллер, Б. Х., Ллойд, К. К., Магнусон, Т., Мур, М. В., Надь, А.,… Замбрович, Б. (2004). Проект мыши с нокаутом. Генетика природы, 36 (9), 921–924. https://doi.org/10.1038/ng0904-921
9. Информационный бюллетень о мышах-нокаутах. (нет данных). Получено с https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet
10. Ллойд К. С. (2011). Ресурс о мышах для биомедицинских исследователей. Анналы Нью-Йоркской академии наук, 1245, 24–26. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2011.06311.x
11. Лауреат Нобелевской премии доктор Оливер Смитис прочтет лекцию, предоставленную графом Х. Моррисом 10 июля (без даты). Получено с https://medicine.wright.edu/about/article/2009/smithieslecture
12. НАЦИОНАЛЬНЫЕ ИНСТИТУТЫ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ США. (нет данных). Почему мышь имеет значение. Получено с https://www.genome.gov/10001345/importance-of-mouse-genome
