Cre-рекомбиназа

Cre-рекомбиназа является производным от фермента тирозин-рекомбиназы из бактериофага Р1. Фермент использует механизм топоизомеразы I для выполнения событий сайт-специфической рекомбинации. Фермент (38 кДа) является членом семейства сайт-специфичных рекомбиназ интегразы и, как известно, катализирует событие сайт-специфической рекомбинации между двумя сайтами узнавания ДНК (сайты LoxP ). Этот сайт узнавания loxP из 34 пар оснований (п.о.) состоит из двух палиндромных последовательностей 13 п.н., которые фланкируют спейсерную область 8 п.н. Продукты Cre-опосредованной рекомбинации на сайтах loxP зависят от местоположения и относительной ориентации сайтов loxP. Два отдельных вида ДНК, оба из которых содержат сайты loxP, могут подвергаться слиянию в результате рекомбинации, опосредованной Cre. Последовательности ДНК, обнаруженные между двумя сайтами loxP, называются «флоксированными ». В этом случае продукты рекомбинации, опосредованной Cre, зависят от ориентации сайтов loxP. ДНК, обнаруженная между двумя сайтами loxP, ориентированными в одном направлении, будет вырезана как кольцевая петля ДНК, в то время как промежуточная ДНК между двумя сайтами loxP, которые ориентированы противоположно, будет инвертирована. Фермент не требует дополнительных кофакторов (таких как АТФ ) или дополнительных белков для своей функции.

Фермент играет важную роль в жизненном цикле бактериофага P1, например как циклизация линейного генома и разделение димерных хромосом, которые образуются после репликации ДНК.

Cre-рекомбиназа является широко используемым инструментом в области молекулярной биологии. Уникальная и специфическая система рекомбинации фермента используется для манипулирования генами и хромосомами в огромном диапазоне исследований, таких как исследования гена нокаут или нокаутируют. Способность фермента эффективно работать в широком диапазоне клеточных сред (включая млекопитающих, растения, бактерии и дрожжи) позволяет использовать систему рекомбинации Cre-Lox в огромном количестве организмов, что делает ее особенно полезный инструмент в научных исследованиях.

Содержание

1 Discovery
2 Структура
- 2.1 Активный сайт
3 Приложения
- 3.1 Роль в бактериофаге P1
- 3.2 Использование в исследованиях
4 Усовершенствования
5 См. Также
6 Ссылки
7 Внешние ссылки

Discovery

Исследования, проведенные в 1981 году Штернбергом и Гамильтоном, продемонстрировали, что бактериофаг «P1» имел уникальную специфичность для сайта. система рекомбинации. EcoRI фрагменты бактериофага P1 генома были созданы и клонированы в лямбда-векторы. Было обнаружено, что фрагмент EcoRI размером 6,5 т.п.н. (фрагмент 7) допускает эффективные события рекомбинации. Было известно, что механизм этих событий рекомбинации уникален, поскольку они происходят в отсутствие бактериальных белков RecA и RecBCD. Компоненты этой системы рекомбинации были выяснены с использованием исследований мутагенеза с делецией . Эти исследования показали, что и продукт гена P1, и сайт рекомбинации необходимы для того, чтобы происходила эффективная рекомбинация. Продукт гена P1 был назван Cre (cвызывает reкомбинацию), а сайт рекомбинации был назван loxP (lo cus of cross (x) over, P 1). Белок Cre был очищен в 1983 году, и было обнаружено, что он составляет 35000 Да. Для рекомбиназной активности очищенного белка не требуются высокоэнергетические кофакторы, такие как АТФ или дополнительные белки. Ранние исследования также продемонстрировали, что Cre связывается с неспецифическими последовательностями ДНК, имея при этом в 20 раз более высокую аффинность к последовательностям loxP, и результаты ранних исследований ДНК-футпринтинга также показали, что молекулы Cre связывают сайты loxP как димеры.

Мультяшная модель Cre-рекомбиназы, связанной со своим субстратом (ДНК). Вид сбоку

Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Аминоконцевой домен показан синим цветом, а карбоксильный домен - зеленым. (Вид сбоку)

Мультяшная модель рекомбиназы Cre, связанной с ее субстратом (ДНК). Аминоконцевой домен показан синим, а карбоксильный домен - зеленым. (Взгляд сверху)

Члены семейства тирозин-рекомбиназ
рекомбиназа S.cerevisiae Flp
Бактериальная рекомбиназа XerC
Бактериальная рекомбиназа XerD
λ-интеграза
Интеграза-белок HP1

Структура

Cre-рекомбиназа состоит из 343 аминокислот, которые образуют два отдельных домена. Аминоконцевой домен включает остатки 20–129, и этот домен содержит 5 альфа-спиральных сегментов, связанных серией коротких петель. Спирали A и E участвуют в образовании тетрамера рекомбиназы с С-концевой областью спирали Е, которая, как известно, образует контакты с С-концевым доменом соседних субъединиц. Спирали B и D образуют прямые контакты с большой бороздкой ДНК loxP. Считается, что эти две спирали образуют три прямых контакта с основаниями ДНК в сайте loxP. карбоксиконцевой домен фермента состоит из аминокислот 132–341 и содержит активный сайт фермента. Общая структура этого домена имеет большое структурное сходство с каталитическим доменом других ферментов того же семейства, таких как интеграза λ и интеграза HP1. Этот домен имеет преимущественно спиральную структуру с 9 отдельными спиралями (F-N). Концевая спираль (N) выступает из основной части карбокси-домена, и считается, что эта спираль играет роль в опосредовании взаимодействий с другими субъединицами. Кристаллические структуры демонстрируют, что эта концевая спираль N погружает свою гидрофобную поверхность в акцепторный карман соседней субъединицы Cre.

Эффект двухдоменной структуры заключается в формировании C-образного зажима, который захватывает ДНК с противоположной стороны. сторон.

Активный сайт

Мультяшная модель активного сайта Cre-рекомбиназы. Фермент связан со своим субстратом (ДНК).

На этой мультипликационной модели Cre-рекомбиназы, связанной с ее субстратом (ДНК), аминокислоты, участвующие в активном сайте, показаны красным цветом и помечены. Это изображение создается после расщепления ДНК.

Активный сайт фермента Cre состоит из консервативных остатков каталитической триады Arg 173, His 289, Arg 292, а также консервативные нуклеофильные остатки Tyr 324 и Trp 315. В отличие от некоторых ферментов рекомбиназы, таких как рекомбиназа Flp, Cre не образует общий активный сайт между отдельными субъединицами, и все остатки, которые вносят вклад в активный сайт, находятся в одной субъединице. Следовательно, когда две молекулы Cre связываются в одном сайте loxP, присутствуют два активных сайта. Cre-опосредованная рекомбинация требует образования синапса, в котором два комплекса Cre-LoxP связываются с образованием так называемого тетрамера синапса, в котором присутствуют 4 различных активных сайта. Tyr 324 действует как нуклеофил с образованием ковалентной 3'-фосфотирозиновой связи с субстратом ДНК. ножничный фосфат (фосфат, нацеленный на нуклеофильную атаку на сайт расщепления) координируется боковыми цепями 3 аминокислотных остатков каталитической триады (Arg 173, His 289 Trp 315). индол азот в триптофане 315 также образует водородную связь с этим подвижным фосфатом. (n.b A Гистидин занимает этот сайт в других членах семейства тирозин-рекомбиназ и выполняет ту же функцию). Эта реакция расщепляет ДНК и освобождает 5’-гидроксильную группу. Этот процесс происходит в активном центре двух из четырех субъединиц рекомбиназы, присутствующих в тетрамере синапса. Если 5'-гидроксильные группы атакуют 3'-фосфотирозиновую связь, одна пара нитей ДНК обменивается с образованием соединения Холлидея промежуточное соединение.

Применения

Роль в бактериофаге P1

Cre-рекомбиназа играет важную роль в жизненном цикле бактериофага P1. При инфицировании клетки система Cre-loxP используется для того, чтобы вызвать циркуляризацию ДНК P1. В дополнение к этому Cre также используется для разделения димерной лизогенной ДНК P1, которая образуется во время клеточного деления фага.

Использование в исследованиях

Простота и надежность систем Cre-loxP имеют позволили ученым использовать фермент Cre для манипулирования ДНК как in vivo, так и in vitro. Подробнее см. Рекомбинация Cre-Lox. Фермент Cre может быть экспрессирован во многих различных организмах, таких как растения, бактерии, млекопитающие, дрожжи. В 1992 году Cre был экспрессирован и оказался функциональным в мыши-хозяине. Промоторными областями можно управлять, чтобы обеспечить точный временной контроль экспрессии фермента Cre (например, чувствительный к RU486 химерный регулятор GLVP). Поскольку фермент имеет специфический ДНК-субстрат размером 34 п.н., геном организма должен иметь длину 10 п.н., чтобы мог появиться сайт loxP. Поскольку геномы млекопитающих в среднем находятся в области 3 × 10 п.н., вероятность обнаружения эндогенного сайта loxP очень мала. Чтобы Cre работал на чужом хосте, необходимо сконструировать экзогенные сайты loxP. Это позволяет точно контролировать активность фермента Cre в тестовых организмах.

Независимо, Джо З. Цзянь стал пионером в использовании системы Cre-loxP для нейробиологических исследований для достижения манипуляции генами, зависящими от типа и региона клеток, во взрослом мозге, где сотни отдельных нейронов типы могут существовать, и почти все нейроны в мозге взрослого человека находятся в постмитотическом состоянии. Цзянь и его коллеги продемонстрировали, что Cre-обусловленная рекомбинация может происходить в постмитотических пирамидных нейронах переднего мозга взрослых мышей. Явная демонстрация его полезности в точном определении сложных взаимоотношений между конкретными клетками / цепями и поведением для исследования мозга подтолкнула NIH к инициированию проекта NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre-driver для мышей в начале 2000 года. На сегодняшний день NIH Blueprint for В рамках проектов Neuroscience Research Cre было создано несколько сотен линий мыши с драйверами Cre, которые в настоящее время используются мировым сообществом нейробиологов.

Улучшения

В последние годы рекомбиназа Cre была усовершенствована за счет преобразования в предпочтительные кодоны млекопитающих, удаления сообщенных загадочных сайтов сплайсинга, изменен стоп-кодон и уменьшено содержание CpG, чтобы снизить риск эпигенетического сайленсинга у млекопитающих. Также был идентифицирован ряд мутантов с повышенной точностью.

См. Также

Ссылки

Внешние ссылки

Cre рекомбиназа в Национальной медицинской библиотеке США Медицинские предметные заголовки (MeSH)