Войти
| Эритронолидсинтаза | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||||||||
| Номер ЕС | 2.3.1.94 | ||||||||
| Номер CAS | 87683- 77-0 | ||||||||
| Базы данных | |||||||||
| IntEnz | Представление IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Запись BRENDA | ||||||||
| ExPASy | Представление NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Запись KEGG | ||||||||
| MetaCyc | метаболический путь | ||||||||
| PRIAM | профиль | ||||||||
| PDB структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Онтология гена | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
В энзимологии, эритронолидсинтаза (также 6-дезоксиэритронолид B синтаза или DEBS ) - это фермент, который катализирует химическую реакцию
7-КоА + 6-дезоксиэритронолид BТаким образом, два субстрата этого фермента являются малонил-КоА и пропаноил-КоА, тогда как два его продукта представляют собой КоА и. Этот фермент участвует в.
Этот фермент принадлежит к семейству трансфераз, он был идентифицирован как часть модуля поликетидсинтазы типа 1 . DEBS содержится в Saccharopolyspora erythraea и других актинобактериях и отвечает за синтез макролидного кольца, которое является предшественником антибиотика эритромицина. На сегодняшний день идентифицированы три категории поликетидсинтаз: тип 1, 2 и 3. Тип 1 синтазы включает в себя большие многодоменные белки, содержащие все сайты, необходимые для синтеза поликетида. Синтазы второго типа содержат активные сайты, распределенные между несколькими меньшими полипептидами, а синтазы третьего типа представляют собой большие мультибелковые комплексы, содержащие модули, которые имеют один активный центр для каждой стадии синтеза поликетида. В случае DEBS есть три больших многофункциональных белка, DEBS 1, 2 и 3, каждый из которых существует как димер из двух модулей. Каждый модуль состоит как минимум из сайта кетосинтазы (KS), белка-носителя ацила (ACP) и ацилтрансферазы (AT), но может также содержать Кеторедуктаза (KR), дегидротаза (DH) и энолредуктаза (ER) для дополнительных реакций восстановления. Комплекс DEBS также содержит загрузочный домен в модуле 1, состоящий из белка-носителя ацила и ацилтрансферазы. Терминал тиоэстераза действует исключительно для прекращения синтеза поликетида DEBS и циклизации макролидного кольца.
Активный центр этого фермента имеет очень широкую специфичность, который позволяет синтезировать длинные цепочки из атомов углерода путем соединения через t хиоэфирная связь, небольшие органические кислоты, такие как уксусная и малоновая кислота. Домен KS получает растущую поликетидную цепь от вышестоящего модуля и впоследствии катализирует образование связи CC между этим субстратом и связанным с ACP блоком удлинителя, который выбирается доменом AT.
Каждый домен AT содержит -карбоксилированный тиоэфир КоА (т.е. метилмалонил-КоА). Эта специфичность предотвращает несущественное добавление ферментов в модуль. АТ захватывает нуклеофильный блок удлинителя β-карбоксиацил-КоА и переносит его на плечо фосфопантетеин домена АСР.
Функционирует посредством катализа переноса ацила от метилмалонил-КоА к домену ACP в том же модуле через ковалентный промежуточный ацил-AT. Важность АТ для строгого включения конкретной единицы удлинителя в синтез строительных блоков поликетида делает жизненно важным, чтобы механизм и структура этих доменов были хорошо выяснены для разработки эффективных стратегий для региоспецифических разработка включения удлинителя в поликетид биосинтез.
ACP не является субстрат-специфичным, что позволяет взаимодействовать с каждым доменом, присутствующим в его модуле. Этот белок взаимодействует с доменом кетосинтазы (KS) того же модуля, чтобы катализировать удлинение поликетидной цепи, и впоследствии взаимодействует с доменом KS следующего модуля, чтобы облегчить прямую передачу цепи. ACP сначала принимает удлинитель от AT, затем взаимодействует с доменом KS в удлинении цепи и, наконец, закрепляет недавно удлиненную цепь, поскольку она претерпевает модификацию в β-кето-положении. Для выполнения своей функции ACP-домены требуют посттрансляционного добавления фосфопантетеиновой группы к консервативному остатку серина ACP. Конечная сульфгидрильная группа фосфопантетеина представляет собой сайт присоединения растущей поликетидной цепи.
Расположена на С-конце в самом дальнем нижележащем модуле. Он заканчивается тиоэстеразой, которая высвобождает зрелый поликетид (либо в виде свободной кислоты, либо в виде циклизованного продукта) посредством лактонизации.
Примечание: как указано выше, первый модуль DEBS содержит дополнительную ацилтрансферазу и ACP. для инициирования реакций
Дополнительные компоненты могут иметь любой из следующих компонентов или их комбинацию:
Кеторедуктаза - Использует НАДФН для стереоспецифического восстановления его до гидроксильной группы
Дегидратаза - Катализирует удаление гидроксильной группы с образованием двойной связи из органических соединений в форме воды
Энолредуктаза - использует НАДФН для восстановления двойной связи из органического соединения
Синтез жирных кислот у большинства прокариот происходит за счет синтазы типа II, состоящей из множества ферментов, расположенных в цитоплазме, которые можно разделить. Однако некоторые бактерии, такие как Mycobacterium smegmatis, а также млекопитающие и дрожжи, используют синтазу типа I, которая представляет собой большой многофункциональный белок, аналогичный к синтазе, используемой для синтеза поликетидов. Эта синтаза типа I включает дискретные домены, на которых катализируются отдельные реакции.
Как в синтезе жирных кислот, так и в синтезе поликетидов промежуточные соединения ковалентно связаны с АСР или ацильным белком-носителем. Однако при синтезе жирных кислот исходные молекулы представляют собой ацил-КоА или малонил-КоА, но пойкетид-синтазы могут использовать несколько праймеров, включая Ацетил-КоА, пропионил-КоА, Изобутирл-КоА, Циклогексаноил-КоА, 3-амино-5-гидроксибензоил-КоА или циннамил-КоА. Как в синтезе жирных кислот, так и в синтезе поликетидов эти носители КоА будут заменены на АСР, прежде чем они будут включены в растущую молекулу.
На стадиях удлинения синтеза жирных кислот кетосинтаза, кеторедуктаза, дегидратаза и еноилредуктаза все используются последовательно для создания насыщенной жирной кислоты, затем может быть проведена постсинтетическая модификация для создания ненасыщенная 4 или циклическая жирная кислота. Однако при синтезе поликетидов эти ферменты можно использовать в различных комбинациях для создания сегментов поликетида, которые являются насыщенными, ненасыщенными или имеют функциональную группу гидроксил или карбонил. Существуют также ферменты, используемые как в синтезе жирных кислот, так и в синтезе поликетидов, которые могут вносить изменения в молекулу после того, как она была синтезирована.
Что касается регулирования длины синтезируемой молекулы, то конкретный механизм, с помощью которого длина цепи жирных кислот остается неизвестным, но ожидается, что цепи ACP-связанных жирных кислот правильной длины действуют как аллостерические ингибиторы ферментов синтеза жирных кислот. При синтезе поликетидов синтазы состоят из модулей, в которых порядок ферментативных реакций определяется структурой белкового комплекса. Это означает, что как только молекула достигает последней реакции последнего модуля, поликетид высвобождается из комплекса ферментом тиоэстеразой. Следовательно, регулирование длины цепи жирных кислот, скорее всего, обусловлено аллостерической регуляцией, а регулирование длины поликетида обусловлено специфическим ферментом в составе поликетидсинтазы.
С конца 1980-х и начала 1990-х годов исследований поликетидсинтаз (PKS) был разработан и прояснен ряд стратегий генетической модификации таких PKS. Такие изменения в PKS представляют особый интерес для фармацевтической промышленности, поскольку новые соединения с антибиотическими или другими антимикробными эффектами обычно синтезируются после внесения изменений в структуру PKS. Разработка комплекса PKS - гораздо более практичный метод, чем синтез каждого продукта с помощью химических реакций in vitro из-за стоимости реагентов и количества реакций, которые должны иметь место. Чтобы проиллюстрировать потенциальные выгоды от синтеза новых и эффективных противомикробных препаратов, в 1995 году мировые продажи эритромицина и его производных превысили 3,5 миллиарда долларов. В этой части будут рассмотрены модификации структуры в DEBS PKS для создания новых продуктов в отношении производных эритромицина, а также полностью новых поликетидов, генерируемых различными способами создания модульного комплекса.
Существует пять основных методов, с помощью которых DEBS регулярно изменяется:
1. Удаление или деактивация активных сайтов и модулей
2. Замена или добавление активных сайтов и модулей
3. Биосинтез, направленный на предшественники
4. Замена KR на измененную стереоспецифичность
5. Адаптация модификаций ферментов
Первый зарегистрированный случай генной инженерии DEBS поступил в 1991 году от группы Katz, которая удалила активность KR в модуле 5 DEBS, который продуцировал 5-кето макролид вместо обычного 5-гидроксимакролида. С тех пор были созданы делеции или инактивация (часто путем введения точечных мутаций) многих активных сайтов, чтобы пропустить реакции восстановления и / или дегидратации. Такие модификации нацелены на различные активные сайты KR, DH, ER, видимые в разных модулях в DEBS. Фактически, целые модули могут быть удалены, чтобы уменьшить длину цепи поликетидов и изменить обычно наблюдаемый цикл восстановления / дегидратации.
В одной из первых реорганизаций DEBS копия терминального ТЕ была помещена в конец каждого модуля в отдельных испытаниях, которые, как и предполагалось, привели к расщеплению и высвобождению соответственно укороченных продуктов. Вслед за этим были разработаны все более сложные методы добавления или замены одного или нескольких активных сайтов в комплекс DEBS.
Наиболее распространенным методом конструирования DEBS с 2005 г. является замена AT, при которой нативный домен AT заменяется на AT, специфичный для другого праймера или молекулы-удлинителя. В нормальных условиях DEBS имеет «загрузочный» или праймирующий AT, специфичный преимущественно для пропионил-CoA, тогда как все шесть последующих AT специфичны для молекулы-удлинителя, метилмалонил-CoA. Все нативные AT из DEBS были успешно заменены на AT из других модульных PKS, таких как PKS, которые продуцируют рапамицин; который заменяет специфичный для метилмалонил-КоА AT на малонил-КоА AT и дает неметилированное производное эритромицина. Этот способ разработки, в частности, демонстрирует универсальность, которая может быть достигнута, поскольку как молекула-затравка, так и молекула-расширитель могут быть изменены для производства многих новых продуктов. В дополнение к сайтам АТ любой из активных сайтов восстанавливающего / дегидратирующего фермента может быть заменен одним или несколькими дополнительными активными сайтами восстанавливающего / дегидратирующего фермента. Например, в одном исследовании KR модуля 2 DEBS был заменен полным набором восстановительных доменов (DH, ER и KR), полученных из модуля 1 рапамицина PKS, как показано на рисунке 2. РИСУНОК 2
. по крайней мере один отчет о замене всего модуля, в котором модуль 2 DEBS был заменен модулем 5 рапамицина PKS. Активности двух модулей идентичны, и один и тот же предшественник эритромицина (6-дезоксиэритронолид B) производился химерным ПКС; однако это показывает возможность создания ПКС с модулями из двух или даже нескольких различных ПКС для производства множества новых продуктов. Однако есть одна проблема с подключением гетерологичных модулей; недавно появились доказательства того, что последовательность аминокислоты между доменом ACP и последующим доменом KS нижележащих модулей играет важную роль в переносе растущего поликетида от одного модуля к другому. Эти области были помечены как «линкеры», и хотя они не имеют прямой каталитической роли, любая замена линкерного участка, который структурно несовместим с PKS дикого типа, может вызвать низкие выходы ожидаемого продукта.
Используя полусинтетический подход, промежуточный дикетид может быть добавлен либо in vitro, либо in vivo к комплексу DEBS, в котором активность первый KS был удален. Это означает, что дикетид загрузится на второй KS (в модуле 2 DEBS) и будет обрабатываться до конца как обычно. Было показано, что этот второй KS довольно неспецифичен, и большое количество синтетических дикетидов могут быть приняты и впоследствии полностью удлинены и высвобождены. Однако также было замечено, что этот KS не очень толерантен к структурным изменениям в положениях C2 и C3, особенно если изменяется стереохимия . На сегодняшний день это был наиболее успешный подход к созданию макролидов с эффективностью, равной или большей, чем эритромицин.
В модульных PKS активные центры KR катализируют стереоспецифическое снижение поликетиды. Инверсия стереоцентра спирта в противоположный стереоизомер возможна посредством замены KR дикого типа на KR противоположной специфичности. Это редко удавалось успешно, и только на терминале KR комплекса DEBS. Было высказано предположение, что изменение стереоспецифичности KR в более раннем модуле также потребует одновременной модификации всех последующих KS.
Недавние исследования аминокислотной последовательности двух типов стереоспецифичности в KR определили идеальная корреляция с этими остатками и прогнозируемым стереохимическим результатом. Это особенно полезно в ситуациях, когда последовательность гена модульного PKS известна, но структура конечного продукта еще не выяснена.
Ферменты, которые действуют на макролид после его высвобождения и циклизации с помощью DEBS, называются ферментами адаптации. Многие такие ферменты участвуют в производстве эритромицина из конечного продукта немодифицированного DEBS, 6-дезоксиэритронолида B. Такие классы ферментов включают в основном оксидоредуктазы и гликозилтрансферазы и необходимы для антибиотическая активность эритромицина.
До сих пор было сделано немного попыток изменить пути адаптации, однако ферменты, которые участвуют в таких путях, в настоящее время охарактеризованы и представляют большой интерес. Исследования облегчаются тем, что их соответствующие гены расположены рядом с генами PKS, и поэтому многие из них легко идентифицируются. Нет сомнений в том, что в будущем изменение ферментов адаптации может привести к появлению множества новых и эффективных противомикробных препаратов.
По состоянию на конец 2007 г. для этого класса ферментов было решено 8 структур с кодами доступа PDB 1KEZ, 1MO2, 1PZQ, 1PZR, 2HG4, 2JU1, 2JU2 и 2QO3.
Другие названия этого класса ферментов - малонил-КоА: пропаноил-КоА малонилтрансфераза (циклизирующая). Другие широко используемые названия включают фермент, конденсирующий эритронолид, и малонил-КоА: пропионил-КоА малонилтрансферазу (циклизирующую).
