Войти
Структура PDE2 с фосфатом в виде палочек и каталитическими металлами в виде сфер. (PDB : 1Z1L )Фермент PDE2 (фосфодиэстераза 2) является одной из 21 различных фосфодиэстераз (PDE) обнаружены у млекопитающих. Эти различные PDE можно подразделить на 11 семейств (PDE1 - PDE11). Различные PDE одного и того же семейства функционально связаны, несмотря на то, что их последовательности аминокислот показывают значительное расхождение. PDE имеют различные субстратные специфичности. Некоторые из них являются цАМФ селективными гидролазами (PDE 4, -7 и -8), другие - цГМФ селективные гидролазы (PDE 5, -6 и -9), а остальные могут гидролизовать как cAMP, так и cGMP (PDE1, -2, -3, -10 и -11
Существует только одно семейство гена, кодирующее PDE2, а именно PDE2A. Было обнаружено три варианта сплайсинга : PDE2A1, PDE2A2 и PDE2A3 ( PDE2A2 был обнаружен только у крыс). PDE2A1 является цитозольным, тогда как -A2 и -A3 связаны с мембраной. Было высказано предположение, что PDE2A2 и -A3 имеют разную локализацию. за счет уникальной N-концевой последовательности, которая отсутствует в PDE2A1. Несмотря на то, что варианты сплайсинга PDE2A отличаются, нет известных различий в их кинетическом поведении.
Сообщалось о кристаллической структуре активного центра фермента PDE2. Даже несмотря на то, что последовательности аминокислот для членов семейства PDE демонстрируют значительные различия (25-35% идентичности), общая укладка, функциональные и структурные элементы активных сайтов очень похожи. активный сайт образован остатками, которые являются высококонсервативными среди всех PDE. Связывающий карман содержит участки связывания иона металла (цинка и магния). Два остатка гистидина и два остатка аспарагиновой кислоты, которые связывают цинк, являются консервативными среди всех изученных PDE. Была выяснена структура нескольких других изоферментов PDE, и среди них несколько структур сокристаллов с ингибиторами, находящимися в активном центре. Структуры сокристаллов PDE4B, PDE4D и PDE5 A выявили две общие особенности связывания ингибитора с PDE. Один представляет собой планарную кольцевую структуру ингибиторов, которые выстраиваются в активном сайте ферментов, а другой - консервативный остаток глутамина («глутаминовый переключатель упомянутый ниже), который важен для распознавания и селективности нуклеотида.
цАМФ (слева) и цГМФ право. Природные субстраты для PDE2. Как упоминалось выше, PDE2 может гидролизовать как цАМФ, так и цГМФ, тогда как некоторые другие члены семейства PDE селективны в отношении любого из двух циклических нуклеотиды. Считается, что вариабельность селективности в отношении цАМФ или цГМФ определяется так называемым «переключателем глутамина». «Переключатель глутамина» представляет собой инвариант глутамин, обнаруженный во всех PDE, для которых кристаллическая структура была решена. В PDE2 этим остатком является Gln859. Он может образовывать водородные связи с экзоциклической аминогруппой цАМФ и экзоциклическим карбонильным кислородом цГМФ. В PDE, которые могут гидролизовать как цАМФ, так и цГМФ, этот глутамин может свободно вращаться. В PDE, которые являются селективными в отношении цАМФ или цГМФ, этот глутамин ограничен соседними остатками в положении, благоприятствующем селективности по циклическому нуклеотиду.
Когда цГМФ связывается с аллостерическим GAF-B домена PDE, он вызывает конформационное изменение в структуре белка, что приводит к более высокой активности фермента. Повышенный гидролиз цАМФ из-за связывания цГМФ с доменом GAF-B хорошо документирован, однако нет известных примеров обратного. Было показано, что домен GAF-B имеет в 30-100 раз меньшую аффинность для cAMP, чем для cGMP. Эта информация в сочетании с тем, что в настоящее время известно о внутриклеточных концентрациях цАМФ, делает маловероятным, что активация цГМФ гидролиза цАМФ может иметь место in vivo.
PDE2 выражается в различных тканях, например: мозговое вещество надпочечников, мозг, сердце, тромбоциты, макрофаги и эндотелиальные клетки. Предполагается, что фермент участвует в регуляции множества различных внутриклеточных процессов, таких как:
Сообщалось о нескольких ферментативных функциях PDE2. Было показано, что PDE2 снижает цАМФ за счет увеличения цГМФ, вызванного предсердным натрийуретическим пептидом (ANP), что приводит к снижению секреции альдостерона . Было также высказано предположение, что PDE2 может играть важную роль в регуляции повышенных внутриклеточных концентраций цАМФ и цГМФ в тромбоцитах. PDE3 играет важную роль в агрегации тромбоцитов. Сообщалось, что более высокая концентрация цГМФ вызывает ингибирование PDE3, тогда как она стимулирует PDE2. Взаимодействие между этими двумя функциями, по-видимому, опосредует противоположную регуляцию цАМФ в тромбоцитах. ФДЭ2 регулирует ток Са L-типа сердца в сердечных миоцитах, где активация ФДЭ2 цГМФ снижает цАМФ и тем самым влияет на сердечную функцию. Однако недавно было обнаружено, что разные пулы цАМФ, расположенные в сердечном миоците, опосредуют разные (более того, иногда противоположные) эффекты. Поскольку разные типы PDE могут влиять на разные пулы цАМФ, разные PDE могут регулировать разные процессы в клетке. PDE2 экспрессируется в нескольких областях мозга, и эксперименты на крысах показали, что ингибирование PDE2 улучшает такие функции, как память. PDE2 активируется, когда моноциты дифференцируются в макрофаги, но роль PDE2 в созревших макрофагах еще предстоит охарактеризовать. Кроме того, было показано, что PDE2 играет роль в воспалительных ответах, поскольку он был обнаружен в микрососудах, но не в более крупных сосудах. Было высказано предположение, что фактор некроза опухоли альфа (TNFα) может регулировать функцию PDE2 в эндотелиальных клетках и тем самым влиять на поток жидкости и клеток через эндотелиальный барьер, как Эксперименты in vitro на эндотелиальных клетках демонстрируют регуляцию как мРНК PDE2 , так и активности... До сих пор ингибиторы PDE2 в основном использовались в качестве инструментов исследования, но в настоящее время исследуются для улучшения память, для уменьшения эндотелиальной проницаемости при воспалительных состояниях и для предотвращения / улучшения сердечной недостаточности и гипертрофии сердца.
EHNA 
Оксиндол 
Bay 60-7550 
PDP Первым специфическим ингибитором, разработанным для PDE2, был EHNA (эритро-9- (2-гидрокси- 3-нонил) аденин). Было продемонстрировано, что он специфически действует на PDE2, ингибируя cGMP-активацию PDE2 со значением IC 50 ~ 1 мкМ и по меньшей мере 50-кратной селективностью по сравнению с другими PDE. Структура ядра EHNA похожа на цАМФ, но отличается тем, что EHNA имеет объемную гидрофобную углеродную боковую цепь, заменяющую фосфорибозный фрагмент в цАМФ.
В первичных культурах крыс кортикальных нейронов, ингибирование PDE2A с помощью EHNA потенцирует NMDA (N-метил- D -аспартат) рецептор активировал увеличение цГМФ, но не влияет на концентрацию цАМФ. EHNA также является очень мощным ингибитором аденозиндезаминазы с IC 50 ~ 2 нМ. Это двойное ингибирование приведет к накоплению двух ингибирующих метаболитов, аденозина и цГМФ, которые могут действовать в синергии, опосредуя различные фармакологические реакции, включая противовирусные, противоопухолевые и противоопухолевые. -аритмические эффекты. Хотя EHNA сильно ингибирует аденозиндезаминазу, она успешно использовалась с надлежащими средствами контроля в качестве инструмента для исследования функций PDE2. EHNA использовалась для изучения влияния PDE2 на контроль кальция в сердечных миоцитах и показала свою эффективность в обращении гипоксического легочного вазоконстрициума на моделях перфузии легких. Таким образом, EHNA использовалась для двух целей:
Однако Использование EHNA в качестве химического инструмента для определения фармакологической роли PDE2 ограничено из-за его низкой способности ингибировать PDE2 и высокой эффективности ингибирования аденозиндезаминазы. Теоретически эту проблему можно решить, если учесть и скорректировать эффект аденозина, накопленного EHNA в результате ингибирования аденозиндезаминазы. Таким образом, наблюдался положительный инотропный эффект, вызываемый EHNA в результате ингибирования PDE2.
BAY 60-7550 представляет собой аналог EHNA, который более чем в 100 раз более эффективен и обладает высокой селективностью в отношении PDE2A. Другими недавно открытыми селективными ингибиторами PDE2 являются PDP (9- (6-фенил-2-оксогекс-3-ил) -2- (3,4-диметоксибензил) пурин-6-он) и оксиндол.
| Ингибитор | IC50 | Ссылка |
| EHNA | 1 мкМ | |
| Оксиндол | 40 нМ | |
| Bay 60-7550 | 4,7 нМ | |
| PDP | 0,6 нМ |
В таблице выше показана эффективность ингибиторов PDE2, включая EHNA. Между EHNA, Bay 60-7550 и PDP наблюдается значительное повышение эффективности. Большая диметоксибензильная группа в положении 2 пуриновой части Bay-60 7550 и PDP может вносить вклад в дополнительную эффективность.
Сравнение этих ингибиторов с естественными субстратами фермента, цАМФ и цГМФ выявило некоторые общие характеристики молекул. Основной характеристикой всех молекул является плоский фрагмент, содержащий по меньшей мере две конденсированные кольцевые структуры, кольцо из шести атомов и кольцо из пяти атомов. Эта кольцевая система в cGMP и cAMP представляет собой пуриновую кольцевую систему, и то же самое верно для EHNA и PDP. Bay 60-7550 и оксиндол не имеют пуринового ядра, но имеют родственную кольцевую систему. Акцепторы водородной связи, в основном азот, но также кислород, находятся в кольцевой системе ингибиторов. Эти атомы могут взаимодействовать с донаторами водородных связей, которые являются частью аминокислот в активном центре фермента, и тем самым способствовать ингибированию ферментом гидролиза цАМФ и цГМФ подобно тому, как природные субстраты связываются с активным центром.
Структуры Bay 60-7550 и PDP очень похожи. Разница между этими молекулами заключается в экзоциклической метил группе в заливе 60-7550, которая заменяет атом азота в PDP, уменьшая возможность образования водородных связей с ферментом в важном для связывание субстрата и ингибитора. Структура оксиндола отличается от других ингибиторов, поскольку она более отличается от кольцевой системы пурина и имеет меньше возможностей связывания водорода. В молекуле также отсутствует большая боковая группа, аналогичная диметоксибензильной группе Bay 60-7550 и PDP. Трудно предсказать возможные взаимодействия с ферментом без сокристаллической структуры явления.
Отсутствуют сокристаллические структуры ингибиторов, связанных в активном сайте PDE2. Однако компьютерный анализ ингибитора EHNA и субстратов цАМФ и цГМФ, связанных в каталитическом сайте, был сделан. стыковочная модель EHNA показала, что мутации аминокислот Asp811 в Ala (Asp811Ala) и Ile826 в Val (Ile826Val) в активном сайте, где единственные аминокислотные замены, которые существенно повлияли на ингибирование EHNA. Мутация Asp811 до аланина увеличивала значение IC 50 для EHNA в 6 раз, а мутация Ile826 до валина приводила к 7-кратному увеличению значения IC 50 для EHNA по сравнению с PDE2A дикого типа.
EHNA находится в непосредственной близости от Gln859 в активном центре, который может отдавать две водородные связи N1 и N6 атомов азота в адениновом кольце EHNA. На другом сайте связывающего кармана Asp811 может отдавать другую водородную связь N7 в адениновом кольце, чтобы стабилизировать ингибитор связи. Эта гипотеза подтверждается тем фактом, что мутант Asp811Ala имеет пониженную активность в отношении цАМФ, тогда как активность в отношении цГМФ не изменилась.
Остатки в нижнем кармане связывания может находиться слишком далеко для взаимодействия с ингибитором и, следовательно, может не иметь значения для селективности EHNA. Однако остатки могут играть косвенную роль в селективности EHNA. Ile826 расположен ниже пуринового кольца EHNA и тем самым ограничивает пространство для EHNA. Замена валином меньшего размера (мутация Ile826Val) может увеличить пространство для EHNA и вызвать потерю связывания водорода с остатками в верхнем кармане связывания, улучшая связывание водорода в нижнем кармане связывания. Этот сдвиг взаимодействий может дестабилизировать связывание аденинового кольца EHNA, что может быть причиной более высокого значения IC 50.
Нет моделей для других ингибиторов, кроме EHNA, которые выравнивают на активном сайте. Следовательно, интерпретировать молекулярное связывание труднее. Если посмотреть на ингибиторы и их общее сходство, вполне вероятно, что они связываются с активным сайтом схожим механизмом и что разные боковые группы определяют эффективность ингибитора. Детерминанты специфичности ингибитора в активном центре PDE2 не очень хорошо известны, и лучшее понимание этих детерминант будет способствовать разработке ингибиторов с повышенной эффективностью.
