Войти
Экспериментальные подходы определения структуры из нуклеиновых кислот, таких как РНК и ДНК, могут быть классифицированы в значительной степени биофизических и биохимических методов. Биофизические методы используют фундаментальные физические свойства молекул для определения структуры, включая рентгеновскую кристаллографию, ЯМР и крио-ЭМ. Биохимические методы используют химические свойства нуклеиновых кислот с использованием определенных реагентов и условий для анализа структуры нуклеиновых кислот. Такие методы могут включать химическое зондирование с использованием конкретных реагентов или основываться на естественной или аналоговой химии. Различные экспериментальные подходы обладают уникальными достоинствами и подходят для различных экспериментальных целей.
Рентгеновская кристаллография не является обычным явлением только для нуклеиновых кислот, поскольку ни ДНК, ни РНК не образуют кристаллов. Это происходит из-за большей степени внутреннего беспорядка и динамизма в структурах нуклеиновых кислот и отрицательно заряженных (дезокси) рибозо-фосфатных скеллах, которые отталкиваются друг от друга в непосредственной близости. Следовательно, кристаллизованные нуклеиновые кислоты имеют тенденцию образовывать комплекс с представляющим интерес белком, чтобы обеспечить структурный порядок и нейтрализовать отрицательный заряд.
ЯМР нуклеиновых кислот - это использование ЯМР-спектроскопии для получения информации о структуре и динамике молекул нуклеиновых кислот, таких как ДНК или РНК. По состоянию на 2003 год почти половина всех известных структур РНК была определена с помощью ЯМР-спектроскопии.
ЯМР нуклеиновых кислот использует те же методы, что и ЯМР белков, но имеет несколько отличий. Нуклеиновые кислоты имеют меньший процент атомов водорода, которые обычно наблюдаются в ЯМР, и поскольку двойные спирали нуклеиновых кислот жесткие и примерно линейные, они не складываются сами по себе, давая «дальнодействующие» корреляции. Типы ЯМР, обычно выполняемые с нуклеиновыми кислотами, включают 1 H или протонный ЯМР, 13 C ЯМР, 15 N ЯМР и 31 P ЯМР. Почти всегда используются методы двумерного ЯМР, такие как корреляционная спектроскопия (COSY) и спектроскопия передачи полной когерентности (TOCSY) для обнаружения ядерных взаимодействий через сквозные связи, а также спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY) для обнаружения взаимодействий между ядрами, которые близки к друг друга в космосе.
Параметры, взятые из спектра, в основном кросс-пики NOESY и константы взаимодействия, можно использовать для определения локальных структурных особенностей, таких как углы гликозидной связи, двугранные углы (с использованием уравнения Карплюса ) и конформации сахарной складки. Для крупномасштабной структуры эти локальные параметры должны быть дополнены другими структурными допущениями или моделями, поскольку ошибки складываются при прохождении двойной спирали, и, в отличие от белков, двойная спираль не имеет компактной внутренней части и не сворачивается назад. сам. ЯМР также полезен для исследования нестандартных геометрических форм, таких как изогнутые спирали, спаривание оснований не-Ватсона – Крика и коаксиальное наложение. Это было особенно полезно для исследования структуры природных олигонуклеотидов РНК, которые имеют тенденцию принимать сложные конформации, такие как стержневые петли и псевдоузлы. ЯМР также полезен для исследования связывания молекул нуклеиновой кислоты с другими молекулами, такими как белки или лекарственные препараты, путем наблюдения за тем, какие резонансы смещаются при связывании другой молекулы.
Криогенная электронная микроскопия (крио-ЭМ) - это метод, который использует электронный луч для изображения образцов, которые были криогенно сохранены в водном растворе. Жидкие образцы наносятся пипеткой на небольшие металлические решетки и погружаются в жидкий раствор этан / пропан, который поддерживается очень холодным с помощью ванны с жидким азотом. После этого процесса замораживания молекулы воды в образце не успевают образовать гексагональные решетки, как во льду, и поэтому образец сохраняется в стекловидном водоподобном состоянии (также называемом застеклованным льдом ), что делает эти образцы легче получить изображение с помощью электронного луча. Преимущество крио-ЭМ перед рентгеновской кристаллографией состоит в том, что образцы сохраняются в состоянии водного раствора и не нарушаются образованием кристаллов образца. Одним из недостатков является то, что трудно разделить структуры нуклеиновой кислоты или белка, размер которых меньше ~ 75 килодальтон, отчасти из-за трудности получения достаточного контраста для определения местоположения частиц в этом застеклованном водном растворе. Другой недостаток заключается в том, что для получения информации о структуре образца на атомном уровне требуется сделать много изображений (часто называемых электронными микрофотографиями) и усреднить эти изображения в процессе, называемом реконструкцией одной частицы. Это вычислительно-интенсивный процесс.
Крио-ЭМ - это новая, менее пертурбативная версия просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Это менее опасно, потому что образец не сушится на поверхности, этот процесс сушки часто выполняется в ПЭМ с отрицательным окрашиванием, и поскольку Cryo-EM не требует контрастного вещества, такого как соли тяжелых металлов (например, уранилацетат или фотовольфрамовая кислота), которые также может повлиять на структуру биомолекулы. Просвечивающая электронная микроскопия как метод использует тот факт, что образцы взаимодействуют с пучком электронов, и только те части образца, которые не взаимодействуют с электронным пучком, могут «проходить» в систему обнаружения электронов. ТЕМ, в целом, является полезным методом определения структуры нуклеиновых кислот с 1960-х годов. Хотя структура двухцепочечной ДНК (дцДНК) традиционно не может считаться структурой, в типичном смысле чередования сегментов одно- и двухцепочечных областей, в действительности дцДНК - это не просто идеально упорядоченная двойная спираль в каждом месте ее длины. из-за тепловых колебаний в ДНК и альтернативных структур, которые могут образовывать подобные g-квадруплексы. КриоЭМ нуклеиновой кислоты была сделана на рибосомах, вирусной РНК и структурах одноцепочечной РНК внутри вирусов. Эти исследования позволили разрешить структурные особенности при разном разрешении от уровня азотистых оснований (2-3 ангстрем) до мотивов третичной структуры (более нанометра).
Схематическое изображение, поясняющее этапы типичного эксперимента с химическим зондированием для анализа структуры молекул РНК. При химическом зондировании РНК используются химические вещества, которые вступают в реакцию с РНК. Важно отметить, что их реакционная способность зависит от локальной структуры РНК, например, от спаривания оснований или доступности. Следовательно, различия в реактивности могут служить следом структуры вдоль последовательности. Разные реагенты реагируют в разных положениях в структуре РНК и имеют разные спектры реактивности. Последние достижения позволяют одновременно изучать структуру многих РНК (зондирование всего транскриптома) и прямой анализ молекул РНК в их клеточной среде (зондирование внутри клетки).
Структурированная РНК сначала реагирует с зондирующими реагентами в течение заданного времени инкубации. Эти реагенты будут образовывать ковалентный аддукт на РНК в месте реакции. Когда РНК подвергается обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы в копию ДНК, полученная ДНК усекается в местах реакции, поскольку фермент блокируется аддуктами. Таким образом, совокупность молекул ДНК различной укороченной длины сообщает частоту реакции в каждой позиции основания, что отражает профиль структуры вдоль РНК. Это традиционно проверяется путем прогона ДНК на геле, и интенсивность полос сообщает частоту наблюдения усечения в каждой позиции. Последние подходы используют высокопроизводительное секвенирование для достижения той же цели с большей пропускной способностью и чувствительностью.
Профиль реактивности может использоваться для изучения степени структуры в определенных положениях для конкретных гипотез или использоваться в сочетании с вычислительными алгоритмами для создания полной экспериментально подтвержденной модели структуры.
В зависимости от используемого химического реагента некоторые реагенты, например гидроксильные радикалы, вместо этого расщепляют молекулу РНК. Результат в усеченной ДНК такой же. Некоторые реагенты, например DMS, иногда не блокируют обратную транскриптазу, а вместо этого вызывают ошибку на сайте копии ДНК. Их можно обнаружить при использовании высокопроизводительных методов секвенирования, и иногда они используются для улучшения результатов зондирования в качестве мутационного профилирования (MaP).
Позиции на РНК могут быть защищены от реагентов не только локальной структурой, но и связывающим белком над этим положением. Это привело к некоторой работе по использованию химического зондирования для анализа связывания с белками.
Гель для определения гидроксильных радикалов с полосами в положениях и точками, указывающими на силу защиты. Поскольку гидроксильные радикалы в растворе недолговечны, их необходимо генерировать в ходе эксперимента. Это можно сделать с помощью H 2 O 2, аскорбиновой кислоты и комплекса Fe (II) -EDTA. Эти реагенты образуют систему, которая генерирует гидроксильные радикалы с помощью химии Фентона. Затем гидроксильные радикалы могут реагировать с молекулами нуклеиновой кислоты. Гидроксильные радикалы атакуют рибозно-дезоксирибозное кольцо, что приводит к разрыву сахарно-фосфатного остова. Сайты, защищенные от связывающих белков или третичной структуры РНК, будут расщепляться гидроксильным радикалом с меньшей скоростью. Следовательно, эти положения будут проявляться как отсутствие полос на геле или низкий сигнал при секвенировании.
Диметилсульфат, известный как DMS, представляет собой химическое вещество, которое можно использовать для модификации нуклеиновых кислот с целью определения вторичной структуры. Реакция с DMS добавляет в этот участок метиловый аддукт, известный как метилирование. В частности, DMS метилирует N1 аденина (A) и N3 цитозина (C), оба расположены в месте естественных водородных связей при спаривании оснований. Следовательно, модификация может происходить только в азотистых основаниях A и C, которые являются одноцепочечными, с парными основаниями на конце спирали, или в паре оснований на или рядом с парой колебаний GU, причем последние два являются положениями, в которых пары оснований может иногда открываться. Более того, поскольку модифицированные сайты не могут быть спарены по основанию, сайты модификации могут быть обнаружены с помощью RT-PCR, где обратная транскриптаза отстает на метилированных основаниях и дает различные усеченные кДНК. Эти усеченные кДНК можно идентифицировать с помощью гель-электрофореза или высокопроизводительного секвенирования.
Улучшение методов, основанных на усечении, мутационное профилирование DMS с секвенированием (DMS-MaPseq) может обнаруживать несколько модификаций DMS в одной молекуле РНК, что позволяет получать больше информации за одно чтение (для чтения 150 нт, обычно две-три мутации сайтов, а не сайтов усечения от нуля до единицы), определяют структуры РНК с низким содержанием и идентифицируют субпопуляции РНК с альтернативными вторичными структурами. DMS-MaPseq использует термостабильную обратную транскриптазу интрона группы II (TGIRT), которая создает мутацию (а не усечение) в кДНК, когда она встречает основание, метилированное DMS, но в остальном она осуществляет обратную транскрипцию с высокой точностью. Секвенирование полученной кДНК позволяет определить, какие основания были мутированы во время обратной транскрипции; эти основания не могли быть спаренными в исходной РНК.
Модификация DMS также может быть использована для ДНК, например, для отпечатков ДНК-белковых взаимодействий.
S плановое 2'- ч ydroxyl cylation анализировали с помощью р Ример е Xtension или ВГК, имеет преимущество реагентов, которые предпочтительно изменяют основную цепь РНК в структурно гибких регионах.
1-метил-7-нитроизатный ангидрид (1M7) подвергается гидролизу с образованием аддуктов на основной цепи неспаренных нуклеотидов РНК. Реагенты, такие как N-метилизатовый ангидрид (NMIA) и 1-метил-7-нитроизатоновый ангидрид (1M7), реагируют с 2'-гидроксильной группой с образованием аддуктов на 2'-гидроксиле основной цепи РНК. По сравнению с химическими веществами, используемыми в других методах зондирования РНК, эти реагенты имеют то преимущество, что они в значительной степени не зависят от идентичности оснований, оставаясь при этом очень чувствительными к конформационной динамике. Нуклеотиды, которые ограничены (обычно спариванием оснований), демонстрируют меньшее образование аддуктов, чем нуклеотиды, которые не являются спаренными. Образование аддукта количественно определяют для каждого нуклеотида в данной РНК путем удлинения праймера комплементарной ДНК с помощью обратной транскриптазы и сравнения полученных фрагментов с фрагментами из немодифицированного контроля. Таким образом, SHAPE сообщает о структуре РНК на уровне отдельных нуклеотидов. Эти данные можно использовать в качестве входных для создания высокоточных моделей вторичных структур. SHAPE использовалась для анализа различных структур РНК, в том числе всего генома ВИЧ-1. Лучшим подходом является использование комбинации химических реагентов для зондирования и экспериментальных данных. В SHAPE-Seq SHAPE расширяется за счет мультиплексирования на основе штрих-кода в сочетании с RNA-Seq и может выполняться с высокой пропускной способностью.
Структура CMCT, используемая при зондировании структуры РНК 
Механизм реакции урацила и карбодиимидов Карбодиимид фрагмент может также образовывать ковалентные аддукты в облученном нуклеотидных, которые урацил, и в меньшей степени, гуанин, при нуклеофильной атаке на депротонированную N. Они реагируют в первой очереди с N3 урацила и N1 гуанина модифицирующих два участка, ответственных за водородные связи на базы.
1-циклогексил- (2-морфолиноэтил) карбодиимид metho- р -толуол сульфонат, также известный как CMCT или CMC, является наиболее часто используемым карбодиимид для структуры РНК зондирующего. Подобно DMS, его можно обнаружить с помощью обратной транскрипции с последующим гель-электрофорезом или высокопроизводительным секвенированием. Поскольку он реагирует на G и U, его можно использовать для дополнения данных экспериментов по зондированию DMS, которые информируют A и C.
1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид, также известный как EDC, представляет собой водорастворимый карбодиимид, который проявляет такую же реакционную способность, как CMC, и также используется для химического исследования структуры РНК. EDC способен проникать в клетки и, таким образом, используется для прямого внутриклеточного зондирования РНК в их естественной среде.
Кетоксал образует ковалентный циклический аддукт с гуанином. 
Механизм взаимодействия 1,2-дикарбонилов с гуанином. Некоторые 1,2- дикарбонильные соединения способны реагировать с одноцепочечным гуанином (G) по N1 и N2, образуя пятичленный кольцевой аддукт на грани Уотсона-Крика.
1,1-Дигидрокси-3-этокси-2-бутанон, также известный как кетоксал, имеет структуру, связанную с 1,2-дикарбонилами, и был первым в этой категории, широко используемым для химического исследования РНК. Кетоксал вызывает модификацию гуанина, специфически изменяя N1 и экзоциклическую аминогруппу (N2) одновременно за счет ковалентного взаимодействия.
Глиоксаль, метилглиоксаль и фенилглиоксаль, которые все несут ключевой 1,2-дикарбонильный фрагмент, все реагируют со свободными гуанинами, как кетоксал, и могут использоваться для исследования неспаренных гуаниновых оснований в структурированной РНК. Благодаря своим химическим свойствам эти реагенты могут легко проникать в клетки и поэтому могут использоваться для анализа РНК в их естественной клеточной среде.
Светоактивируемое структурное исследование РНК (ЛАЗЕР) При зондировании используется ультрафиолетовый свет для активации никотиноилазида (NAz), генерирующего высокореактивный катион нитрения в воде, который реагирует с доступным для растворителя гуанозином и аденозином РНК в положении C-8 через безбарьерный фридель-азид. Ремесла реакция. Лазерное зондирование нацелено как на одноцепочечные, так и на двухцепочечные остатки, если они доступны для растворителя. Поскольку зондирование гидроксильных радикалов требует синхротронного излучения для измерения доступности РНК для растворителей in vivo, во многих лабораториях трудно применить зондирование гидроксильных радикалов к следовой РНК в клетках. Напротив, при ЛАЗЕРНОМ зондировании используется переносная УФ-лампа (20 Вт) для возбуждения, гораздо проще применить ЛАЗЕРНОЕ зондирование для изучения доступности растворителя РНК in vivo. Этот метод химического зондирования регулируется светом и исследует доступность азотистых оснований для растворителя, которая, как было показано, оставляет след в клетках, связывающих РНК-белки.
Тестирование в режиме реального времени гуаниновых рибопереключателей, показывающее изменение гибкости в ответ на различные нуклеотидные лиганды Встроенное зондирование не включает обработку каким-либо химическим веществом или реагентом для модификации структур РНК. В этом типе зондирования используется структурно-зависимое расщепление РНК; одноцепочечные области более гибки и нестабильны и со временем деградируют. Процесс поточного зондирования часто используется для определения изменений в структуре из-за связывания лиганда. Связывание лиганда может приводить к различным паттернам расщепления. Процесс поточного зондирования включает инкубацию структурных или функциональных РНК в течение длительного периода времени. Этот период может составлять несколько дней, но варьируется в каждом эксперименте. Затем инкубированные продукты наносят на гель для визуализации полос. Этот эксперимент часто проводят с использованием двух различных условий: 1) с лигандом и 2) в отсутствие лиганда. Расщепление приводит к более короткой длине полосы и указывает на области, которые не спарены по основанию, поскольку спаренные по основанию области имеют тенденцию быть менее чувствительными к спонтанному расщеплению. In-line зондирование - это функциональный анализ, который можно использовать для определения структурных изменений в РНК в ответ на связывание лиганда. Он может напрямую показать изменение гибкости и связывания областей РНК в ответ на лиганд, а также сравнить этот ответ на аналогичные лиганды. Этот анализ обычно используется в динамических исследованиях, особенно при исследовании рибопереключателей.
Картирование интерференции нуклеотидных аналогов (NAIM) - это процесс использования аналогов нуклеотидов, молекул, которые в некотором смысле похожи на нуклеотиды, но не имеют функции, для определения важности функциональной группы в каждом месте молекулы РНК. Процесс NAIM заключается во вставке однонуклеотидного аналога в уникальный сайт. Это можно сделать, транскрибируя короткую РНК с помощью РНК-полимеразы Т7, затем синтезируя короткий олигонуклеотид, содержащий аналог в определенном положении, а затем лигируя их вместе на матрице ДНК с помощью лигазы. Аналоги нуклеотидов маркируются фосфоротиоатом, активные члены популяции РНК затем отделяются от неактивных членов, затем из неактивных членов удаляется фосфоротиоатная метка, а сайты аналога идентифицируются с помощью гель-электрофореза и авторадиографии. Это указывает на функционально важный нуклеотид, так как расщепление фосфоротиоата йодом приводит к РНК, которая расщепляется в месте вставки аналога нуклеотида. Путем обработки этих усеченных молекул РНК на геле интересующий нуклеотид можно идентифицировать с помощью эксперимента по секвенированию. Результаты сайт-направленного включения указывают на важные положения, когда при работе с гелем функциональные РНК, содержащие аналог, включенный в это положение, будут иметь полосу. присутствует, но если аналог приводит к нефункциональности, когда функциональные молекулы РНК работают на геле, полосы, соответствующей этому положению на геле, не будет. Этот процесс можно использовать для оценки всей области, где аналоги размещены в конкретных местах, отличающихся одним нуклеотидом, затем, когда функциональные РНК выделяются и запускаются на геле, все области, где образуются полосы, указывают на несущественные нуклеотиды, но области, где полосы отсутствуют в функциональной РНК, указывают на то, что вставка аналога нуклеотида в это положение приводила к тому, что молекула РНК становилась нефункциональной.
