Войти
| Ацетоацетатдекарбоксилаза | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Ацетоацетатдекарбоксилаза додекамер структура со связанным 2-пентаноном на своих активных сайтах. | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Номер EC | 4.1.1.4 | ||||||||
| Номер CAS | 9025-03-0 | ||||||||
| Базы данных | |||||||||
| IntEnz | IntEnz view | ||||||||
| BRENDA | Запись BRENDA | ||||||||
| ExPASy | Просмотр NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Запись KEGG | ||||||||
| MetaCyc | метаболический путь | ||||||||
| PRIAM | профиль | ||||||||
| PDB структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Онтология генов | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
ацетоацетатдекарбоксилаза(AADили ADC) - это фермент, участвующий в кетоновом теле путь продукции у людей и других млекопитающих и сольвентогенез у бактерий. Ацетоацетатдекарбоксилаза играет ключевую роль в производстве растворителей, катализируя декарбоксилирование ацетоацетата с образованием ацетона и диоксида углерода.
. Этот фермент представляет особый интерес, поскольку он классический пример того, как pKa значения ионизируемых групп в ферменте активный центр могут быть значительно нарушены. В частности, значение pKa лизина 115 в активном центре необычно низкое, что позволяет образовывать промежуточное соединение основания Шиффа и катализировать.
| ацетоуксусная кислота | Ацетоацетатдекарбоксилаза | ацетон | |
| CO2 | |||
.
Ацетоацетатдекарбоксилаза - это фермент, имеющий большое историческое значение, особенно в Первой мировой войне и в создании государства из Израиля. Во время войны союзникам требовался чистый ацетон в качестве растворителя для нитроцеллюлозы, легковоспламеняющегося соединения, являющегося основным компонентом пороха. В 1916 году биохимик и будущий первый президент Израиля Хаим Вейцман первым выделил Clostridium acetobutylicum, грамположительные, анаэробные бактерии, в которых обнаружена ацетоацетатдекарбоксилаза. Вейцман смог использовать способность организма выделять ацетон из крахмала для массового производства взрывчатых веществ во время войны. Это побудило правительства США и Великобритании внедрить процесс, разработанный Хаимом Вейцманном, на нескольких крупных заводах в Англии, Франции, Канаде и Соединенных Штатах. Благодаря научному вкладу Вейцмана в Первую мировую войну он сблизился с влиятельными британскими лидерами, ознакомив их с его сионистскими убеждениями. Одним из них был Артур Бальфур, человек, в честь которого была названа Декларация Бальфура - первый документ, провозглашающий поддержку Великобритании в создании еврейской родины.
Производство ацетона ацетоацетатдекарбоксилазосодержащими или клостридиальными бактериями было использовано в крупномасштабных промышленных синтезах в первой половине двадцатого века. В 1960-х годах промышленность заменила этот процесс менее дорогим и более эффективным химическим синтезом ацетона из нефти и нефтепродуктов. Однако растет интерес к производству ацетона, который является более экологически чистым, что приводит к возрождению использования бактерий, содержащих ацетоацетатдекарбоксилазу. Точно так же становится популярной ферментация изопропанола и бутанола с использованием клостридиальных видов.
Ацетоацетатдекарбоксилаза представляет собой комплекс 365 кДа с гомододекамерной структурой. Общая структура состоит из антипараллельных β-листов и центрального семинитевого конуса β-ствола. Ядро этого β-цилиндра окружает активный центр каждого протомера фермента. Активный сайт, состоящий из таких остатков, как Phe 27, Met97 и Tyr113, в основном гидрофобен. Однако активный сайт действительно содержит два заряженных остатка: Arg29 и Glu76.
Arg29, как полагают, играет роль в связывании субстрата, в то время как Glu76, как полагают, играет роль в ориентации активных сайт для катализа. Общая гидрофобная среда активного центра играет решающую роль в благоприятствовании нейтральной аминной форме Lys115, ключевому остатку, участвующему в образовании промежуточного соединения основания Шиффа. Считается, что другой важный остаток лизина, Lys116, играет важную роль в позиционировании Lys115 в активном сайте. Посредством водородных связей с Ser16 и Met210, Lys116 позиционирует Lys115 в гидрофобном кармане активного центра, благоприятствуя нейтральной форме амина.
Ацетоацетатдекарбоксилаза из Clostridium acetobutylicum катализирует декарбоксилирование ацетоацетата с образованием ацетона и углерода диоксид (рисунок 1). Механизм реакции протекает через образование промежуточного соединения основания Шиффа, которое ковалентно присоединено к лизину 115 в активном центре. Первое подтверждение этого механизма было получено в эксперименте по радиоактивной метке, в котором исследователи пометили карбонильную группу ацетоацетата с помощью O и обнаружили, что кислородный обмен на воду, используемую в качестве растворителя, является необходимая часть стадии декарбоксилирования. Эти результаты подтверждают, что механизм протекает через промежуточное соединение основания Шиффа между кетокислотой и аминокислотным остатком на ферменте.
Дальнейшие исследования привели к выделению последовательности активного сайта пептида и идентификации активного сайта лизина, Lys115, который участвует в образовании промежуточного соединения основания Шиффа. Кроме того, более поздние эксперименты привели к обнаружению, что максимальная активность фермента наблюдается при pH 5,95, предполагая, что pK aε-аммониевой группы Lys115 значительно нарушается в активных сайт. Если бы pK aне было изменено вниз, остаток лизина оставался бы протонированным в виде катиона аммония, делая его инертным для нуклеофильного добавления, необходимого для образования основания Шиффа.
Фиг. 2: Схема реакции с репортерной молекулой 5-NSA, использованная Westheimer et al. для измерения pKa Lys115 в активном сайте.Основываясь на этом открытии, Westheimer et al. непосредственно измеряли pK aLys115 в активном сайте с использованием (5-NSA). Реакция 5-NSA с ацетоацетатдекарбоксилазой и последующее восстановление образовавшегося основания Шиффа боргидридом натрия привели к включению репортерной молекулы 2-гидрокси-5-нитробензиламино в активный центр (рис. 2). Титрование фермента с этой присоединенной репортерной группой показало, что pK aLys115 снижается до 5,9 в активном сайте. Эти результаты послужили основой для предположения, что нарушение pK aLys115 было связано с его близостью к положительно заряженной ε-аммониевой группе Lys116 в активном центре. Соседний положительный заряд может вызвать неблагоприятное электростатическое отталкивание, которое ослабляет связь N-H в Lys115. Предложение Westheimer et al. Было дополнительно подтверждено исследованиями сайт-направленного мутагенеза. Когда Lys116 был мутирован в цистеин или аспарагин, было обнаружено, что pK aLys115 значительно увеличился до более чем 9,2, что указывает на то, что положительно заряженный Lys116 играет решающую роль. роль в определении pK aLys115. Хотя кристаллическая структура еще не была решена, чтобы предоставить структурные доказательства, это предложение было широко принято и цитировалось в качестве учебного примера того, как можно точно организовать активный центр для возмущения pK aи влияют на реактивность.
В 2009 году была решена кристаллическая структура ацетоацетатдекарбоксилазы из Clostridium acetobutylicum, что позволило оценить предложение Вестхаймера и др. с новой точки зрения. По кристаллической структуре исследователи обнаружили, что Lys 115 и Lys 116 ориентированы в противоположных направлениях и разделены расстоянием 14,8 Å (Рисунок 3). Это расстояние делает маловероятным то, что положительный заряд Lys116 может влиять на pK aLys115. Вместо этого за счет водородных связей с Ser16 и Met210, Lys116, вероятно, удерживает Lys115 в положении в гидрофобном кармане активного сайта. Такое расположение нарушает стабильность протонированного катиона аммония Lys115, предполагая, что возмущение pK aLys115 происходит через «эффект десольватации ».
Рисунок 3: Ориентация лизина 115 и 116. В активном центре лизин 115 и 116 направлены друг от друга и разделены на 14,8 Å. Это изображение было создано с использованием PyMOL из PDB ID 3BH3.Ацетоацетатдекарбоксилаза ингибируется рядом соединений. Уксусный ангидрид выполняет электрофильную атаку на критический каталитический остаток, Lys115, ацетоацетатдекарбоксилазы, чтобы инактивировать фермент. Скорость инактивации оценивали по гидролизу синтетического субстрата 2,4-динитрофенилпропионата до динитрофенола с помощью ацетоацетатдекарбоксилазы. В присутствии уксусного ангидрида фермент инактивируется, неспособный катализировать реакцию гидролиза 2,4-динитрофенилпропионата до динитрофенола.
Ацетонилсульфонат действует как конкурентный ингибитор (KI= 8,0 мМ) как он имитирует характеристики природного субстрата, ацетоацетата (K M = 8,0 мМ). Моноанионная версия ацетонилфосфоната также является хорошим ингибитором (K I = 0,8 мМ), более эффективным, чем моноэфир ацетонилфосфоната или дианион. Эти данные показывают, что активный сайт очень дискриминационный и стерически ограниченный.
Цианистый водород, по-видимому, неконкурентоспособный ингибитор, сочетающийся с соединениями основания Шиффа, образованными в активном центре. Добавление карбонильных соединений к ферменту в присутствии цианистого водорода увеличивает способность цианида водорода ингибировать ацетоацетатдекарбоксилазу, предполагая, что карбонильные соединения легко образуют основания Шиффа в активном центре. Цианистый водород наиболее эффективен как ингибитор при pH 6, оптимальном pH для фермента, что позволяет предположить, что лимитирующей стадией катализа является образование промежуточного соединения основания Шиффа.
, по-видимому, ингибирует ацетоацетатдекарбоксилазу хорошо, но медленно. Ацетоацетатдекарбоксилаза имеет K M для ацетоацетата 7 × 10 M, тогда как фермент имеет K I для бензоилацетона, равный 1,9 × 10 M. вероятно, образуется при взаимодействии бета-дикетонов со свободным ферментом.
Реакция ацетоацетатдекарбоксилазы с п-хлормеркурифенилсульфонатом (CMS) приводит к снижению каталитической активности при двух эквивалентах CMS на субъединицу фермента. CMS взаимодействует с двумя сульфгидрильными группами, расположенными на каждой субъединице фермента. Дальнейшая инактивация происходит при добавлении третьего эквивалента CMS на субъединицу. Добавление свободного цистеина к ингибированному ферменту способно обратить вспять ингибирование ацетоацетатдекарбоксилазы CMS.
ацетоацетатдекарбоксилаза была обнаружена и изучена у следующих бактерий в дополнение к Clostridium acetobutylicum :
Хотя этот фермент не был очищен из тканей человека, было показано, что активность присутствует в сыворотке крови человека.
У людей и других млекопитающих превращение ацетоацетата в ацетон и диоксид углерода под действием ацетоацетатдекарбоксилазы является последним необратимым этапом пути кетонового тела, который снабжает организм вторичным источником энергии. В печени ацетил-со-А, образованный из жиров и липидов, трансформируется в три кетоновых тела: ацетон, ацетоацетат и D-β-гидроксибутират. Ацетоацетат и D-β-гидроксибутират экспортируются в непеченочные ткани, где они превращаются обратно в ацетил-коА и используются в качестве топлива. Ацетон и углекислый газ, с другой стороны, выдыхаются и не могут накапливаться при нормальных условиях.
Ацетоацетат и D-β-гидроксибутират свободно взаимопревращаются под действием D-β-гидроксибутиратдегидрогеназы. Впоследствии одной функцией ацетоацетатдекарбоксилазы может быть регулирование концентраций других, двух 4-углеродных кетоновых тел.
Производство кетонов в организме значительно возрастает, когда скорость метаболизма глюкозы недостаточна для удовлетворения энергетических потребностей организма. Такие состояния включают повышенное содержание жиров, диабетический кетоацидоз или тяжелое голодание.
При повышенных уровнях ацетоацетата и D-β-гидроксибутирата ацетоацетатдекарбоксилаза производит значительно больше ацетона. Ацетон токсичен и в этих условиях может накапливаться в организме. Повышенный уровень ацетона в дыхании человека может использоваться для диагностики диабета.
