Войти
Фотоактивация - это метод, используемый в биологических исследованиях для специфической активации клеточных игроков (белки, нуклеиновые кислоты, маленькие молекулы ) вспышкой света с целью изучения процессов в клетках. Основной принцип заключается в том, чтобы доставить фотоактивируемый агент (например, небольшую молекулу, модифицированную светочувствительной группой, белки, помеченные символом an) в клетки, ткани или даже живых животных и, в частности, контролировать активность с помощью освещения
Принцип фотоактивации Свет является подходящим внешним триггером для подобных экспериментов, поскольку он неинвазивен и не влияет на нормальные клеточные процессы (следует соблюдать осторожность при использовании света в ультрафиолетовой части спектр, чтобы избежать повреждения ДНК. Кроме того, свет обеспечивает высокий пространственный и временной контроль. Обычно стимул активации исходит от лазера или УФ-лампы и может быть включены в тот же микроскоп, который используется для мониторинга эффекта. Все эти преимущества привели к разработке большого количества различных фотоактивируемых зондов.
Несмотря на то, что стадия активации светом обычно необратима, обратимые изменения могут индуцироваться в количестве фотопереключатели, которые здесь подробно обсуждаться не будут.
Первым зарегистрированным использованием фотозащитных аналогов для биологических исследований был синтез и применение «заключенного в клетку» АТФ Хоффманом в 1978 году в его исследовании Na: K насосов. По сей день АТФ по-прежнему является наиболее часто используемым соединением в клетках. Хоффман также был первым, кто придумал термин «соединение в клетке» для этого типа модифицированных молекул. Эта номенклатура продолжала существовать, даже если она не была правильной с научной точки зрения. Он предлагает изображение молекулы в физической клетке (как в фуллерене ), поэтому ученые попытались ввести более новый, более точный термин «фотоактивируемые зонды». Обе номенклатуры в настоящее время используются. Небольшие молекулы легче модифицировать фоторасщепляемыми группами по сравнению с более крупными конструкциями, такими как белки. В последующие годы были сделаны важные открытия с использованием заключенных в клетки нейротрансмиттеров, таких как глутамат, который используется для картирования функциональных нейронных цепей у млекопитающих срезы мозга. Фотоактивируемые белки были случайно обнаружены намного позже (в 2002 г.), когда было обнаружено, что белок Kaede, когда его оставляют на скамейке под воздействием солнечного света, меняет флуоресценцию на более длинноволновую. (для подробного обзора посетите :)
Белки, которые воспринимают свет и реагируют на него, были первоначально изолированы от фоторецепторов в водорослях, кораллы и другие морские организмы. Два наиболее часто используемых сегодня фотоактивируемых белка в науке - это фотоактивируемые флуоресцентные белки и ретинилиденовые белки. Фотоактивируемые флуоресцентные белки изменяют длину волны излучения на более длинную при освещении УФ-светом. В Kaede это изменение вызвано расщеплением хромофорного трипептида His62-Tyr63-Gly64. Это открытие проложило путь для современных методов микроскопии со сверхвысоким разрешением, таких как PALM или STORM. Ретинилиденовые белки, такие как каналродопсины или галородопсины, являются светочувствительными катионными и хлоридными каналами, которые открываются при освещении синий и желтый свет соответственно. Этот принцип был успешно использован для контроля активности нейронов в живых клетках и даже тканях и дал начало совершенно новой области исследований, оптогенетике.
Нуклеиновые кислоты играют важную роль как хранилище клеточной информации и механизм регуляции генов. В усилиях по регулированию этого механизма с помощью света ДНК и РНК были модифицированы фоторасщепляемыми группами в основной цепи (в подходе, называемом `` статистический каркасный каркас '', защитные группы реагируют в основном с основные фосфатные группы). В организме модифицированные нуклеиновые кислоты «молчат», и только при облучении светом можно включить их активность. Этот подход находит применение в биологии развития, где хронология активности генов представляет особый интерес. Теперь возможно очень точно включать интересующие гены в процессе развития целых организмов.
Маленькие молекулы легко модифицируются путем химического синтеза и поэтому были одними из первых модифицированы и используются в биологических исследованиях. До сегодняшнего дня существует большое разнообразие небольших молекул в клетках, поэтому здесь будет обсуждаться лишь небольшой репрезентативный раздел. Область, в которой все преимущества активации эффекторов светом (точный контроль, быстрый ответ, высокая специфичность, отсутствие перекрестных реакций) особенно интересны при изучении нейротрансмиттеров.
в клетках дофамин, серотонин, глицин и ГАМК были синтезированы, и их влияние на нейронную активность было тщательно изучено.
Не только аминокислоты, но также и ионы могут быть связаны. Поскольку кальций является мощным клеточным вторичным мессенджером, были синтезированы клеточные варианты с использованием свойств захвата ионов EDTA. Индуцированное светом расщепление основной цепи ЭДТА приводит к появлению волны свободного кальция внутри клетки.
Другой класс молекул, используемых для передачи сигналов в клетке, - это гормоны. Было показано, что производные эстрадиола в клетках индуцируют экспрессию гена . при извлечении других замкнутых гормонов использовались для изучения взаимодействий рецептор - лиганд.
Несмотря на то, что долгое время липиды считались строительными блоками клеточных мембран, теперь становится ясно, что некоторые из них также выполняют специфическую функцию в передаче сигналов Чтобы проанализировать роль липидов в определенных путях, полезно иметь возможность очень быстро увеличивать концентрацию сигнального липида. Следовательно, многие сигнальные липиды также были защищены фотоудаляющимися защитными группами, и их влияние на клеточную сигнализацию было изучено. Было показано, что Caged вызывает слияние эндосом. Клетчатый IP3 помог выяснить влияние IP3 на потенциал действия нейронов, а клеточный диацилглицерин был использован для определения влияния длины цепи жирных кислот на PKC-зависимую передачу сигналов.
При изучении белок-липидных взаимодействий другой тип фотоактивации, как оказалось, дает много идей. Фотолабильные группы, такие как диазиридины или бензофеноны, которые после УФ-облучения оставляют после себя высокореактивные ионы карбения, можно использовать для сшивания интересующего липида с его взаимодействующие белки. Эта методология особенно полезна для проверки существующих и обнаружения новых белок-липидных взаимодействий.
