Войти
Микроскопия сверхвысокого разрешения - это серия методов в оптической микроскопии, которые позволяют таким изображениям иметь разрешение выше, чем налагаемое дифракционным пределом, который возникает из-за дифракции света. Методы визуализации сверхвысокого разрешения основаны на ближнем поле (фотонно-туннельная микроскопия, а также микроскопия с суперлинзой Пендри и сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля ) или на дальнем поле. Среди методов, которые полагаются на последний, есть методы, которые улучшают разрешение лишь незначительно (примерно до двух раз) сверх дифракционного предела, такие как конфокальная микроскопия с закрытым точечным отверстием или с помощью вычислительных методов, таких как деконволюция или пиксель на основе детектора. переназначение (например, повторная сканирующая микроскопия, переназначение пикселей), микроскоп 4Pi и технологии микроскопии со структурированным освещением, такие как SIM и SMI.
Существует две основные группы методов микроскопии сверхвысокого разрешения в дальней зоне, которые могут улучшить разрешение в гораздо большем количестве:
8 октября 2014 года Нобелевская премия по химии была присуждена Эрику Бетцигу, У. Мёрнеру и Стефану Хеллу за «разработку флуоресцентной микроскопии со сверхвысоким разрешением », которая переносит « оптическую микроскопию в наноразмерность ». Биомедицинское исследовательское сообщество все чаще принимает различные методы микроскопии сверхвысокого разрешения, и эти методы становятся незаменимыми инструментами для понимания биологических функций на молекулярном уровне.
К 1978 году были разработаны первые теоретические идеи, чтобы преодолеть предел Аббе, который требовал использования микроскопа 4Pi в качестве конфокального лазерно-сканирующего флуоресцентного микроскопа, в котором свет фокусируется со всех сторон в общий фокус, который используется для сканирования объекта. за счет возбуждения «точка за точкой» в сочетании с обнаружением «точка за точкой». Однако публикация 1978 года сделала неправильный физический вывод (то есть точечное пятно света) и полностью упустила увеличение осевого разрешения как фактическую выгоду от добавления другой стороны телесного угла.
Некоторая из следующей информации была собрана (с разрешения) из обзора методов субдифракционной микроскопии в химическом блоге.
В 1986 году Охонин запатентовал оптический микроскоп сверхвысокого разрешения, основанный на вынужденном излучении.
Оптическая случайная микроскопия ближнего поля (NORM) - это метод получения оптического ближнего поля с помощью микроскопа дальнего поля путем наблюдения броуновского движения наночастиц в иммерсионной жидкости.
NORM использует сканирование поверхности объекта стохастически движущимися наночастицами. Под микроскопом наночастицы выглядят как симметричные круглые пятна. Ширина пятна эквивалентна функции рассеяния точки (~ 250 нм) и определяется разрешением микроскопа. Боковые координаты данной частицы можно оценить с точностью, намного превышающей разрешение микроскопа. Собирая информацию из множества кадров, можно составить карту распределения интенсивности поля в ближней зоне по всему полю зрения микроскопа. По сравнению с NSOM и ANSOM этот метод не требует специального оборудования для позиционирования наконечника, имеет большое поле зрения и глубину резкости. Благодаря большому количеству сканирующих «сенсоров» можно добиться получения изображения за более короткое время.
4Pi микроскоп представляет собой лазерный сканирующий флуоресцентный микроскоп с улучшенным осевым разрешением. Типичное значение 500–700 нм может быть улучшено до 100–150 нм, что соответствует почти сферическому фокусному пятну с объемом в 5–7 раз меньшим, чем у стандартной конфокальной микроскопии.
Улучшение разрешения достигается за счет использования двух противоположных линз объектива, обе из которых сфокусированы в одном и том же геометрическом месте. Кроме того, тщательно минимизируется разница в длине оптического пути через каждую из двух линз объектива. Благодаря этому молекулы, находящиеся в общей фокусной области обоих объективов, могут когерентно освещаться с обеих сторон, а отраженный или испускаемый свет может собираться когерентно, то есть возможно когерентное наложение испускаемого света на детектор. Телесный угол, который используется для освещения и обнаружения увеличивается и приближается идеальным случай, когда образец облучаются и обнаруженный со всех сторон одновременно.
До сих пор наилучшее качество в микроскопе 4Pi достигалось в сочетании с микроскопией STED в фиксированных клетках и микроскопией RESOLFT с переключаемыми белками в живых клетках.
Сравнение разрешения, полученного с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (вверху) и микроскопии со структурированным освещением 3D (3D-SIM-Microscopy, внизу). Показаны детали ядерной оболочки. Ядерные поры (анти-NPC) - красный, ядерная оболочка (анти- ламин ) - зеленый, хроматин ( окрашивание DAPI ) - синий. Шкала шкалы: 1 мкм. Микроскопия со структурированным освещением (SIM) улучшает пространственное разрешение за счет сбора информации из частотного пространства за пределами наблюдаемой области. Этот процесс выполняется в обратном пространстве: преобразование Фурье (FT) SI-изображения содержит наложенную дополнительную информацию из разных областей обратного пространства; с несколькими кадрами, в которых освещение сдвинуто на некоторую фазу, можно вычислить разделение и реконструировать изображение FT, которое имеет гораздо больше информации о разрешении. Обратный FT возвращает восстановленное изображение в изображение сверхвысокого разрешения.
SIM-микроскопия потенциально может заменить электронную микроскопию в качестве инструмента для постановки некоторых медицинских диагнозов. К ним относятся диагностика заболеваний почек, рака почек и болезней крови.
Хотя термин «микроскопия со структурированным освещением» был придуман другими в более поздние годы, Guerra (1995) впервые опубликовал результаты, в которых свет, сформированный решеткой с шагом 50 нм, освещал вторую решетку с шагом 50 нм, причем решетки поворачивались относительно каждой из них. другое - на величину угла, необходимую для увеличения. Хотя длина волны освещения составляла 650 нм, решетка 50 нм легко разрешалась. Это показало почти 5-кратное улучшение по сравнению с пределом разрешения Аббе 232 нм, который должен был быть наименьшим полученным для используемой числовой апертуры и длины волны. В дальнейшем развитии этой работы Гуэрра показал, что сверхразрешенная боковая топография достигается за счет фазового сдвига исчезающего поля. Несколько патентов США были выданы Герре индивидуально или вместе с коллегами и переданы корпорации Polaroid. Лицензии на эту технологию были приобретены Dyer Energy Systems, Calimetrics Inc. и Nanoptek Corp. для использования этого метода сверхвысокого разрешения в оптическом хранении данных и микроскопии.
Сравнительная конфокальная микроскопия - 3D-SIM
Ядро клетки в профазе с разных сторон
Два ядра мышиных клеток в профазе.
клетка мыши в телофазе
SMI + TIRF ткани глаза человека, пораженной дегенерацией желтого пятна Одна реализация структурированного освещения известна как пространственно-модулированное освещение (SMI). Подобно стандартному структурированному освещению, метод SMI соответствующим образом изменяет функцию рассеяния точки (PSF) микроскопа. Однако в этом случае «само оптическое разрешение не улучшается»; вместо этого используется структурированное освещение, чтобы максимизировать точность измерения расстояний до флуоресцентных объектов, чтобы «сделать возможными измерения размеров при молекулярных размерах в несколько десятков нанометров».
В микроскопе Vertico SMI структурированное освещение достигается за счет использования одного или двух противоположных лазерных лучей вдоль оси. Затем отображаемый объект перемещается с высокой точностью шагами через волновое поле, или само волновое поле перемещается относительно объекта за счет фазовых сдвигов. Это приводит к улучшенному осевому размеру и разрешающей способности по расстоянию.
SMI можно комбинировать с другими технологиями сверхвысокого разрешения, например, с 3D LIMON или LSI- TIRF в качестве интерферометра полного внутреннего отражения с боковым структурированным освещением (этот последний инструмент и метод, по сути, представляет собой туннельный микроскоп с фазовым сдвигом фотонов, в котором используется полностью внутренний отражательный световой микроскоп со сдвинутым по фазе затухающим полем (Guerra, 1996)). Этот метод SMI позволяет получать светооптические изображения распределения автофлуорофоров в срезах ткани глаза человека с непревзойденным ранее оптическим разрешением. Использование трех различных длин волн возбуждения (488, 568 и 647 нм) позволяет собирать спектральную информацию о сигнале автофлуоресценции. Это было использовано для исследования тканей глаза человека, пораженных дегенерацией желтого пятна.
Микроскопия с обратимыми насыщаемыми оптическими флуоресцентными переходами (RESOLFT) - это оптическая микроскопия с очень высоким разрешением, которая позволяет отображать детали в образцах, которые невозможно получить с помощью традиционной или конфокальной микроскопии. В RESOLFT обобщены принципы STED-микроскопии и GSD-микроскопии. Кроме того, существуют методы с концепциями, отличными от RESOLFT или SSIM. Например, флуоресцентная микроскопия, использующая свойство оптического затвора И для азотно-вакансионного центра или сверхразрешение за счет стимулированной эмиссии теплового излучения (SETR), которая использует внутренние сверхлинейные черты излучения черного тела и расширяет концепцию сверхвысокого разрешения. -разрешение за пределами микроскопии.
Улучшение разрешения между традиционной конфокальной микроскопией и микроскопией STED. Микроскопия истощения с вынужденным излучением (STED) использует два лазерных импульса: импульс возбуждения для возбуждения флуорофоров до их флуоресцентного состояния и импульс STED для снятия возбуждения флуорофоров посредством стимулированного излучения. На практике сначала применяется возбуждающий лазерный импульс, за которым вскоре следует импульс STED (также используется STED без импульсов с использованием лазеров непрерывного действия). Кроме того, импульс STED модифицируется таким образом, что он имеет пятно нулевой интенсивности, которое совпадает с фокусным пятном возбуждения. Из-за нелинейной зависимости скорости стимулированного излучения от интенсивности пучка STED все флуорофоры вокруг фокального пятна возбуждения будут в выключенном состоянии (основное состояние флуорофоров). Сканируя это фокусное пятно, можно получить изображение. Полная ширина на половине максимума (FWHM) функции рассеяния точки (ФРТ) фокального пятна возбуждения теоретически может быть сжат до произвольной ширины за счет повышения интенсивности STED импульса, в соответствии с уравнением ( 1).
Главный недостаток STED, препятствующий его широкому использованию, - сложность оборудования. С одной стороны, скорость получения изображения относительно низкая для больших полей зрения из-за необходимости сканировать образец, чтобы извлечь изображение. С другой стороны, это может быть очень быстро для небольших полей зрения: были показаны записи до 80 кадров в секунду. Из-за большого значения I s, связанного с STED, существует потребность в импульсе возбуждения высокой интенсивности, который может вызвать повреждение образца.
Микроскопия истощения основного состояния (GSD-микроскопия) использует триплетное состояние флуорофора в качестве выключенного состояния и синглетное состояние в качестве включенного состояния, в результате чего лазер возбуждения используется для перемещения флуорофоров на периферии молекулы синглетного состояния в триплетное состояние. Это очень похоже на STED, где выключенное состояние является основным состоянием флуорофоров, поэтому уравнение ( 1) также применимо в этом случае. Это значение меньше, чем в STED, что делает возможным получение изображений со сверхвысоким разрешением при гораздо меньшей интенсивности лазера. Однако по сравнению с STED флуорофоры, используемые в GSD, обычно менее фотостабильны; и насыщение триплетного состояния может быть труднее реализовать.
Микроскопия с насыщенным структурированным освещением (SSIM) использует нелинейную зависимость скорости излучения флуорофоров от интенсивности возбуждающего лазера. Применяя синусоидальный образец освещения с пиковой интенсивностью, близкой к необходимой для насыщения флуорофоров в их флуоресцентном состоянии, можно получить муаровые полосы. Полосы содержат пространственную информацию высокого порядка, которая может быть извлечена вычислительными методами. Как только информация извлечена, извлекается изображение сверхвысокого разрешения.
SSIM требует многократного сдвига образца освещения, что эффективно ограничивает временное разрешение метода. Кроме того, существует потребность в очень фотостабильных флуорофорах из-за условий насыщения, которые вызывают радиационное повреждение образца и ограничивают возможные применения, для которых может использоваться SSIM.
Примеры этой микроскопии показаны в разделе « Микроскопия со структурированным освещением» (SIM): изображения ядер клеток и митотических стадий, записанные с помощью микроскопии 3D-SIM.
Микроскопия локализации одиночных молекул (SMLM) суммирует все микроскопические методы, которые достигают сверхвысокого разрешения за счет изоляции излучателей и сопоставления их изображений с функцией рассеяния точки (PSF). Обычно ширина функции рассеяния точки (~ 250 нм) ограничивает разрешение. Однако, учитывая изолированный излучатель, можно определить его местоположение с точностью, ограниченной только его интенсивностью, в соответствии с уравнением ( 2).
Этот процесс подбора может быть надежно выполнен только для изолированных эмиттеров (см. Деконволюция ), а интересные биологические образцы настолько плотно помечены эмиттерами, что подгонка невозможна, когда все эмиттеры активны одновременно. Методы SMLM решают эту дилемму, активируя одновременно только разреженное подмножество излучателей, очень точно локализуя эти несколько излучателей, деактивируя их и активируя другое подмножество.
Принимая во внимание пикселизацию фона и камеры, а также используя приближение Гаусса для функции рассеяния точки ( диск Эйри ) типичного микроскопа, теоретическое разрешение предложено Thompson et al. и доработано Мортенсеном и др.:
Обычно локализационная микроскопия проводится с помощью флуорофоров. Подходящие флуорофоры (например, для STORM) большую часть времени находятся в нефлуоресцентном темном состоянии и активируются стохастически, обычно с помощью возбуждающего лазера низкой интенсивности. Считывающий лазер стимулирует флуоресценцию и обесцвечивает или фотопереключает флуорофоры обратно в темное состояние, обычно в течение 10–100 мс. При накоплении точек для визуализации в наноразмерной топографии (PAINT) флуорофоры не флуоресцируют до связывания и флуоресцируют после. Фотоны, испускаемые во время фазы флуоресценции, собираются камерой, и результирующее изображение флуорофора (которое искажается PSF) может быть подогнано с очень высокой точностью, даже порядка нескольких ангстрем. Повторение процесса несколько тысяч раз гарантирует, что все флуорофоры могут пройти через яркое состояние и будут записаны. Затем компьютер восстанавливает изображение со сверхвысоким разрешением.
Желательными характеристиками флуорофоров, используемых в этих методах, для максимального увеличения разрешения является то, что они должны быть яркими. То есть они должны иметь высокий коэффициент экстинкции и высокий квантовый выход. Они также должны иметь высокий коэффициент контрастности (соотношение между количеством фотонов, испускаемых в светлом состоянии, и количеством фотонов, испускаемых в темном состоянии). Кроме того, в соответствии с критериями Найквиста желателен образец с плотной маркировкой.
Множество методов локализационной микроскопии в основном различаются типом используемых флуорофоров.
Микроскопия одиночной молекулы YFP со сверхвысоким разрешением / SPDMphymod Одиночный крошечный источник света может быть обнаружен намного лучше, чем обычно позволяет разрешение микроскопа: хотя свет будет давать размытое пятно, можно использовать компьютерные алгоритмы для точного расчета центра размытого пятна с учетом функция рассеяния точки микроскопа, шумовые свойства детектора и т. д. Однако этот подход не работает, когда слишком много источников находится близко друг к другу: тогда все источники размываются вместе.
Спектральная прецизионная дистанционная микроскопия (SPDM) - это семейство методов локализации в флуоресцентной микроскопии, которое позволяет обойти проблему наличия множества источников за счет одновременного измерения всего нескольких источников, так что каждый источник «оптически изолирован» от других (т. Е., разделенных разрешением больше, чем разрешение микроскопа, обычно ~ 200-250 нм), если исследуемые частицы имеют разные спектральные сигнатуры, так что можно одновременно наблюдать свет от нескольких молекул, используя соответствующие источники света. и фильтры. Это обеспечивает эффективное оптическое разрешение в несколько раз лучше, чем обычное оптическое разрешение, которое представлено полушириной основного максимума функции эффективного точечного изображения.
Структурное разрешение, достигаемое с помощью SPDM, может быть выражено через наименьшее измеряемое расстояние между двумя точечными частицами с разными спектральными характеристиками («топологическое разрешение»). Моделирование показало, что при подходящих условиях, касающихся точности локализации, плотности частиц и т. Д., «Топологическое разрешение» соответствует « пространственной частоте », которая, с точки зрения классического определения, эквивалентна значительно улучшенному оптическому разрешению. Молекулы также можно различать еще более тонкими способами на основе времени жизни флуоресценции и других методов.
Важное применение - исследование генома (изучение функциональной организации генома ). Еще одна важная область использования - это исследование структуры мембран.
Двухцветная локализационная микроскопия SPDMфимод / микроскопия сверхвысокого разрешения с использованием гибридных белков GFP и RFP Локализационная микроскопия для многих стандартных флуоресцентных красителей, таких как GFP, красители Alexa и молекулы флуоресцеина, возможна при наличии определенных фотофизических условий. С этой так называемой технологией физически модифицируемых флуорофоров (SPDMphymod) для наноизображения достаточно одной длины волны лазера подходящей интенсивности, в отличие от других технологий локализационной микроскопии, которым требуются две длины волны лазера, когда используются специальные фотопереключаемые / фотоактивируемые молекулы флуоресценции. Еще одним примером использования SPDMphymod является анализ частиц вируса табачной мозаики (TMV) или исследование взаимодействия вируса и клетки.
Основываясь на переходах синглет-триплетных состояний, для SPDMphymod критически важно, чтобы этот процесс продолжался и приводил к тому, что отдельная молекула сначала переходит в очень долгоживущее обратимое темное состояние (с периодом полураспада до нескольких секунд) от в котором он возвращается в флуоресцентное состояние, излучающее множество фотонов в течение нескольких миллисекунд, прежде чем он возвращается в очень долгоживущее, так называемое необратимое темное состояние. В микроскопии SPDMphymod используются флуоресцентные молекулы, которые излучают одинаковую спектральную частоту света, но с разными спектральными характеристиками, основанными на характеристиках мигания. Комбинируя две тысячи изображений одной и той же клетки, можно, используя прецизионные лазерные оптические измерения, записывать изображения локализации со значительно улучшенным оптическим разрешением.
Стандартные флуоресцентные красители, уже успешно используемые с технологией SPDMphymod, - это GFP, RFP, YFP, Alexa 488, Alexa 568, Alexa 647, Cy2, Cy3, Atto 488 и флуоресцеин.
Криогенная оптическая локализация в трех измерениях (COLD) позволяет определить четыре сайта связывания биотина в белке стрептавидине. Криогенная оптическая локализация в 3D (COLD) - это метод, который позволяет локализовать несколько флуоресцентных участков в пределах одной биомолекулы малого и среднего размера с разрешением по шкале Ангстрема. Точность локализации в этом подходе повышается, поскольку более медленная фотохимия при низких температурах приводит к большему количеству фотонов, которые могут испускаться каждым флуорофором до фотообесцвечивания. В результате криогенная микроскопия стохастической локализации достигает субмолекулярного разрешения, необходимого для определения трехмерных положений нескольких флуорофоров, прикрепленных к небольшому белку. Используя алгоритмы, известные из электронной микроскопии, 2D-проекции флуорофоров реконструируются в 3D-конфигурацию. COLD доводит флуоресцентную микроскопию до своего фундаментального предела, в зависимости от размера этикетки. Этот метод также можно комбинировать с другими методами структурной биологии, такими как рентгеновская кристаллография, магнитно-резонансная спектроскопия и электронная микроскопия, для получения ценной дополнительной информации и специфичности.
fBALM Микроскопия локализации одиночных молекул сверхвысокого разрешения с использованием микроскопии локализации с активированным связыванием с помощью флуктуаций структуры ДНК Микроскопия локализации, активируемой связыванием (BALM) - это общая концепция микроскопии локализации одной молекулы (SMLM): визуализация ДНК-связывающих красителей с суперразрешением, основанная на изменении свойств ДНК и красителя. Путем тщательной регулировки химической среды, ведущей к локальному обратимому плавлению ДНК и контролю гибридизации над сигналом флуоресценции, могут быть введены молекулы ДНК-связывающего красителя. Интеркалирующие и связывающие малые бороздки ДНК-красители могут использоваться для регистрации и оптического выделения только нескольких сигналов ДНК-связывающих красителей за раз. БАЛЬЗАМ с помощью флуктуации структуры ДНК (fBALM) был использован для определения различий в ядерной архитектуре на наноуровне с ожидаемым структурным разрешением примерно 50 нм. Визуализация наноструктуры хроматина с помощью микроскопии локализации, активируемой связыванием, на основе флуктуаций структуры ДНК. Недавно значительное увеличение квантового выхода флуоресценции NIAD-4 при связывании с амилоидом было использовано для визуализации амилоидных фибрилл и олигомеров BALM.
Стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM), микроскопия фотоактивированной локализации (PALM) и флуоресцентная микроскопия локализации фотоактивации (FPALM) - это методы визуализации со сверхвысоким разрешением, которые используют последовательную активацию и локализацию с временным разрешением фотопереключаемых флуорофоров для создания изображений с высоким разрешением. Во время визуализации только оптически разрешимое подмножество флуорофоров активируется до флуоресцентного состояния в любой данный момент, так что положение каждого флуорофора может быть определено с высокой точностью путем нахождения положений центроидов изображений отдельных молекул конкретного флуорофора. Одна подгруппа флуорофоров впоследствии деактивируется, а другая подгруппа активируется и отображается. Итерация этого процесса позволяет локализовать множество флуорофоров и построить изображение сверхвысокого разрешения из данных изображения.
Эти три метода были независимо опубликованы в течение короткого периода времени, и их принципы идентичны. STORM был первоначально описан с использованием красителей Cy5 и Cy3, прикрепленных к нуклеиновым кислотам или белкам, тогда как PALM и FPALM были описаны с использованием светопереключаемых флуоресцентных белков. В принципе, можно использовать любой светопереключаемый флуорофор, и STORM продемонстрировал множество различных зондов и стратегий мечения. Используя стохастическое фотопереключение отдельных флуорофоров, таких как Cy5, можно выполнить STORM с одним источником возбуждения красного лазера. Красный лазер переключает флуорофор Cy5 в темное состояние за счет образования аддукта и впоследствии возвращает молекулу в флуоресцентное состояние. Многие другие красители также использовались со STORM.
Помимо отдельных флуорофоров, пары красителей, состоящие из флуорофора-активатора (например, Alexa 405, Cy2 или Cy3) и светопереключаемого репортерного красителя (например, Cy5, Alexa 647, Cy5.5 или Cy7), могут использоваться с STORM.. В этой схеме активаторный флуорофор при возбуждении вблизи его максимума поглощения служит для реактивации фотопереключаемого красителя в флуоресцентное состояние. Многоцветная визуализация была выполнена с использованием различных длин волн активации для различения пар красителей, в зависимости от используемого флуорофора-активатора, или с использованием спектрально различных светопереключаемых флуорофоров, с или без флуорофоров-активаторов. Также можно использовать светопереключаемые флуоресцентные белки. Высокоспецифичное мечение биологических структур фотопереключаемыми зондами было достигнуто с помощью окрашивания антител, прямого конъюгации белков и генетического кодирования.
STORM также был расширен до трехмерной визуализации с использованием оптического астигматизма, в котором эллиптическая форма функции рассеяния точки кодирует положения x, y и z для образцов толщиной до нескольких микрометров, и была продемонстрирована на живых клетках. На сегодняшний день пространственное разрешение, достигаемое с помощью этого метода, составляет ~ 20 нм в боковых размерах и ~ 50 нм в аксиальных размерах; а временное разрешение составляет всего 0,1–0,33 с.
Накопление точек для визуализации в наноразмерной топографии (PAINT) - это метод локализации одной молекулы, который обеспечивает стохастическую флуоресценцию одной молекулы за счет молекулярной адсорбции / поглощения и фотообесцвечивания / десорбции. Первым использованным красителем был нильский красный, который не флуоресцирует в водном растворе, но флуоресцирует при введении в гидрофобную среду, такую как мицеллы или стенки живых клеток. Таким образом, концентрация красителя поддерживается небольшой на наномолярном уровне, так что скорость сорбции молекулы в области, ограниченной дифракцией, находится в миллисекундной области. Стохастическое связывание молекул (зондов) одного красителя с иммобилизованной мишенью может быть пространственно и временно разрешено с помощью типичного широкопольного флуоресцентного микроскопа. Каждый краситель подвергается фотообесцвечиванию, чтобы вернуть поле в темное состояние, чтобы следующий краситель мог связываться и наблюдаться. Преимущество этого метода по сравнению с другими стохастическими методами заключается в том, что помимо получения сверхразрешенного изображения фиксированной мишени, он может измерять динамическую кинетику связывания диффундирующих молекул зонда в растворе с мишенью.
Сочетание техники трехмерного сверхвысокого разрешения (например, функция распределения точек двойной спирали, разработанная в группе Мёрнера), фотоактивированных красителей, активной перемежаемости, зависящей от мощности, и накопления точек для построения изображений в наноразмерной топографии, SPRAIPAINT (SPRAI = сверхразрешение от PoweR- зависимая активная перемежаемость) может сверхразрешать стенки живых клеток. PAINT работает, поддерживая баланс между скоростью адсорбции / абсорбции красителя и фотообесцвечивания / десорбции. Этот баланс можно оценить с помощью статистических принципов. Скорость адсорбции или абсорбции разбавленного растворенного вещества на поверхности или границе раздела в газе или жидком растворе может быть рассчитана с использованием законов диффузии Фика. Скорость фотообесцвечивания / десорбции может быть измерена для заданных условий раствора и плотности мощности освещения.
DNA-PAINT был дополнительно расширен для использования обычных красителей, где динамическое связывание и отсоединение меченого красителем ДНК-зонда с фиксированной ДНК-оригами используется для достижения стохастической визуализации одиночных молекул. DNA-PAINT больше не ограничивается красителями, чувствительными к окружающей среде, и может измерять как адсорбцию, так и кинетику десорбции зондов на мишень. В методе используется эффект размытия движущихся красок камеры. Когда обычный краситель рассеивается в растворе, его изображение на типичной ПЗС-камере размывается из-за его относительно высокой скорости и относительно длительного времени экспозиции камеры, что способствует возникновению фона флуоресценции. Однако, когда он связывается с фиксированной целью, краситель перестает двигаться; и может быть получен четкий ввод в функцию рассеяния точки.
Термин для этого метода - mbPAINT («mb» означает размытие в движении ). Когда для визуализации используется флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF), глубина возбуждения ограничивается ~ 100 нм от подложки, что дополнительно снижает фон флуоресценции от размытых красителей рядом с подложкой и фона в объеме раствора. Для mbPAINT можно использовать очень яркие красители, которые дают типичное однокадровое пространственное разрешение ~ 20 нм и кинетическое временное разрешение для одной молекулы ~ 20 мс при относительно умеренных интенсивностях фотовозбуждения, что полезно при изучении молекулярного разделения отдельных белков.
Временное разрешение было дополнительно улучшено (в 20 раз) с использованием вращающейся фазовой маски, размещенной в плоскости Фурье во время сбора данных, и разрешения искаженной функции рассеяния точки, которая содержит временную информацию. Метод получил название Super Temporal-Resolved Microscopy (STReM).
Локализационная микроскопия без этикеток SPDM - микроскопия сверхвысокого разрешения выявляет ранее не обнаруживаемые внутриклеточные структуры Оптическое разрешение клеточных структур в диапазоне примерно 50 нм может быть достигнуто даже в клетках без меток с помощью локализационной микроскопии SPDM.
Используя две разные длины волн лазера, SPDM выявляет клеточные объекты, которые не обнаруживаются в обычных условиях флуоресцентной визуализации с широким полем, помимо существенного улучшения разрешения автофлуоресцентных структур.
В качестве контроля положение обнаруженных объектов на изображении локализации совпадает с положением на светлопольном изображении.
Микроскопия сверхвысокого разрешения без метки также была продемонстрирована с использованием флуктуаций сигнала комбинационного рассеяния света с усиленной поверхностью на очень однородной плазмонной метаповерхности.
dSTORM использует фотопереключение одного флуорофора. В dSTORM флуорофоры встроены в восстанавливающую и окислительную буферную систему (ROXS), и флуоресценция возбуждается. Иногда, стохастически, флуорофор входит в триплет или какое-либо другое темное состояние, чувствительное к степени окисления буфера, из которого они могут флуоресцировать, чтобы можно было регистрировать положения отдельных молекул. Разработка метода dSTORM происходила в 3 независимых лабораториях примерно в одно время и называлась также «микроскопией обратимого фотообесцвечивания» (RPM), «микроскопией истощения основного состояния с последующим возвращением отдельных молекул» (GSDIM), а также общепринятой в настоящее время прозвище dSTORM.
Локализационная микроскопия в значительной степени зависит от программного обеспечения, которое может точно подогнать функцию рассеяния точки (PSF) к миллионам изображений активных флуорофоров в течение нескольких минут. Поскольку классические методы анализа и программные комплексы, используемые в естественных науках, слишком медленны для решения этих задач с помощью вычислений, и для обработки данных, измеряемых в минутах, часто требуются часы вычислений, были разработаны специализированные программы. Многие из этих программных пакетов для локализации имеют открытый исходный код; они перечислены в SMLM Software Benchmark. Как только положения молекул определены, их необходимо отобразить, и было разработано несколько алгоритмов отображения.
Можно обойти необходимость подгонки PSF, присущей микроскопии локализации одиночных молекул (SMLM), путем прямого вычисления временной автокорреляции пикселей. Этот метод называется визуализацией оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения (SOFI), и было показано, что он более точен, чем SMLM, когда плотность одновременно активных флуорофоров очень высока.
Вездесущая локализационная микроскопия (OLM) - это расширение методов микроскопии одиночных молекул (SMLM), которые позволяют получать изображения одиночных молекул с высокой плотностью с помощью некогерентного источника света (такого как ртутная дуговая лампа) и стандартной установки эпифлуоресцентного микроскопа. Короткая вспышка темно-синего возбуждения (с лазером 350–380 нм вместо 405 нм) обеспечивает длительную реактивацию молекул с разрешением 90 нм на тестируемых образцах. Наконец, корреляционная визуализация STED и SMLM может быть выполнена на одном и том же биологическом образце с использованием простой среды визуализации, которая может обеспечить основу для дальнейшего улучшенного разрешения. Эти результаты могут демократизировать визуализацию сверхвысокого разрешения и помочь любому ученому создавать изображения одиночных молекул с высокой плотностью даже при ограниченном бюджете.
Трехмерная двухцветная микроскопия со сверхвысоким разрешением с Her2 и Her3 в клетках груди, стандартные красители: Alexa 488, Alexa 568 LIMON Изображения световой микроскопической наноразмерной микроскопии (3D LIMON), полученные с помощью микроскопа Vertico SMI, стали возможными благодаря комбинации SMI и SPDM, при этом сначала применяется процесс SMI, а затем SPDM.
Процесс SMI определяет центр частиц и их разброс в направлении оси микроскопа. Хотя центр частиц / молекул может быть определен с точностью до 1-2 нм, разброс вокруг этой точки может быть определен вплоть до осевого диаметра примерно 30-40 нм.
Затем с помощью SPDM определяется поперечное положение отдельной частицы / молекулы с точностью до нескольких нанометров.
В качестве биологического приложения в 3D двухцветном режиме было достигнуто пространственное расположение кластеров Her2 / neu и Her3. Положения во всех трех направлениях кластеров белка можно было определить с точностью около 25 нм.
Комбинация микроскопа сверхвысокого разрешения с электронным микроскопом позволяет визуализировать контекстную информацию с маркировкой, обеспечиваемой флуоресцентными маркерами. Это решает проблему черного фона, которая возникает у исследователя при использовании только светового микроскопа. В интегрированной системе образец измеряется обоими микроскопами одновременно.
В последнее время, благодаря достижениям в области вычислений искусственного интеллекта, нейронные сети с глубоким обучением использовались для повышения сверхвысокого разрешения фотографических изображений с оптического микроскопа, с 40x до 100x, от 20x с помощью оптического микроскопа до 1500x, что сравнимо с растровым электронным микроскопом. через нейронную линзу, а также с помощью позитронно-эмиссионной томографии и флуоресцентной микроскопии.
( 1)
( 2)