Войти
Фотоактивированная локализационная микроскопия (PALM или FPALM ) и микроскопия стохастической оптической реконструкции (STORM) являются широкопольными (в отличие от методов точечного сканирования, таких как лазерная сканирующая конфокальная микроскопия ) флуоресцентная микроскопия методы визуализации, которые позволяют получить изображения с разрешением, превышающим дифракционный предел . Эти методы были предложены в 2006 году в связи с повсеместным появлением методов оптической микроскопии со сверхвысоким разрешением и были отмечены журналом Nature Methods как методы года в 2008 году. Развитие PALM как целевого метода биофизической визуализации во многом было вызвано открытием новых видов и разработкой мутантов флуоресцентных белков, демонстрирующих контролируемый фотохромизм, например фотоактивируемый GFP. Однако в ходе сопутствующей разработки STORM, основанного на том же фундаментальном принципе, первоначально использовались парные цианиновые красители. Одна молекула пары (называемая активатором) при возбуждении вблизи ее максимума поглощения служит для реактивации другой молекулы (называемой репортером) в флуоресцентное состояние.
Все большее количество красителей используется для PALM, STORM и родственных технологий, как органических флуорофоров, так и флуоресцентных белков. Некоторые из них совместимы с визуализацией живых клеток, другие позволяют быстрее получать или более плотно маркировать. Выбор конкретного флуорофора в конечном итоге зависит от области применения и лежащих в его основе фотофизических свойств.
Оба метода претерпели значительные технические усовершенствования, в частности, позволяющие получать многоцветные изображения и расширение до трех измерений с наилучшим текущим осевым разрешением 10 нм в третьем измерении, полученное с использованием интерферометрического подхода с двумя противоположными объективами, собирающими флуоресценцию образца.
Воспроизведение медиа Схематическое представление реконструкции изображения с высоким разрешением путем локализации центроида многих изображений точечного света с низким разрешением. itters Обычная флуоресцентная микроскопия выполняется путем выборочного окрашивания образца флуоресцентными молекулами, либо связанными с антителами, как в иммуногистохимии, либо с использованием флуоресцентных белков, генетически слитых с интересующие гены. Как правило, чем больше концентрация флуорофоров, тем лучше контраст флуоресцентного изображения.
Один флуорофор можно визуализировать под микроскопом (или даже невооруженным глазом), если количество испускаемых фотонов достаточно велико, а фон, напротив, достаточно низкий. Двумерное изображение точечного источника, наблюдаемое под микроскопом, представляет собой протяженное пятно, соответствующее диску Эйри (участок функции рассеяния точки ) системы формирования изображения. Возможность идентифицировать как два отдельных объекта два близко расположенных флуорофора ограничена дифракцией света. Это количественно определяется критерием Аббе, согласно которому минимальное расстояние 
где 
Однако, если излучение двух соседних флуоресцентных молекул сделать различимым, т.е. фотоны, исходящие от каждой из двух, можно идентифицировать, то можно преодолеть дифракционный предел. После того, как набор фотонов от определенной молекулы собран, он образует ограниченное дифракцией пятно в плоскости изображения микроскопа. Центр этого пятна может быть найден путем подгонки наблюдаемого профиля излучения к известной геометрической функции, обычно функции Гаусса в двух измерениях. Ошибка, которая совершается при локализации центра точечного излучателя, масштабируется в первом приближении как обратный квадратный корень из числа излучаемых фотонов, и если собрано достаточно фотонов, легко получить ошибку локализации, намного меньшую, чем исходная точка. функция распространения.
Несколько близко расположенных излучателей неотличимы. Положение точечного источника может быть восстановлено только в том случае, если испускаемые им фотоны были идентифицированы от фотонов, исходящих от соседних молекул. Два этапа идентификации и локализации отдельных флуоресцентных молекул в плотной среде, где многие из них присутствуют, находятся в основы PALM, STORM и их развитие.
Хотя существует много подходов к молекулярной идентификации, индуцированный светом фотохромизм выбранных флуорофоров был разработан как наиболее многообещающий подход для различения соседних молекул путем разделения их флуоресцентного излучения во времени. Включив стохастически редкие подмножества флуорофоров со светом определенной длины волны, отдельные молекулы затем могут быть возбуждены и отображены в соответствии с их спектрами. Чтобы избежать накопления активных флуорофоров в образце, которые в конечном итоге деградировали бы обратно до изображения с ограничением дифракции, в PALM используется спонтанно возникающее явление фотообесцвечивания, тогда как обратимое переключение между флуоресцентным включенным состоянием и темное состояние красителя эксплуатируется в STORM.
Фотоактивация, локализация и обесцвечивание Таким образом, PALM и STORM основаны на сборе под флуоресцентным микроскопом большого количества изображений, каждое из которых содержит всего несколько активных изолированных флуорофоров. Последовательность визуализации позволяет выполнять множество циклов излучения, необходимых для стохастической активации каждого флуорофора из не-излучающего (или менее излучающего) состояния в яркое состояние и обратно в не излучающее или обесцвеченное состояние. Во время каждого цикла плотность активированных молекул поддерживается на достаточно низком уровне, чтобы молекулярные изображения отдельных флуорофоров обычно не перекрывались.
Одиночный кадр ПЗС, отображающий отдельные флуоресцентные белки, возбужденные в режиме полного внутреннего отражения 
Последовательность кадров, содержащих изображения отдельных молекул На каждом изображении последовательности положение флуорофора вычисляется с точностью, обычно превышающей дифракционный предел - в типичном диапазоне от нескольких до десятков нм - и результирующая информация о положении центров всех локализованных молекул используется для построения PALM сверхвысокого разрешения или Изображение ШТОРМА.
Точность локализации 
где N - количество собранных фотонов, a - размер пикселя детектора изображения, 
Требование повышенного отношения сигнал / шум для максимальной точности локализации определяет частую комбинацию этой концепции с широкопольными флуоресцентными микроскопами, позволяющими делать оптические срезы, такими как флуоресцентные микроскопы полного внутреннего отражения (TIRF) и световые флуоресцентные микроскопы.
Разрешение окончательного изображения ограничено точностью каждой локализации и количеством локализаций, а не путем дифракции. Таким образом, изображение со сверхвысоким разрешением является пуантилистическим представлением координат всех локализованных молекул. Изображение со сверхвысоким разрешением обычно визуализируется путем представления каждой молекулы в плоскости изображения как двумерного гауссова с амплитудой, пропорциональной количеству собранных фотонов, и стандартным отклонением, зависящим от точности локализации.
Самоорганизация сети хемотаксиса Escherichia coli, полученная с помощью световой микроскопии сверхвысокого разрешения. Шкала в (A – E) указывает 1 мкм. Масштабная шкала в (F – H) указывает на 50 нм. 
Стратегии для многоцветной локализационной микроскопии. Слева: спектральное разделение. В центре: множественные активаторы (ШТОРМ). Справа: ратиометрическая визуализация Особые фотофизические свойства флуорофоров, используемых в визуализации сверхвысокого разрешения PALM / STORM, создают как ограничения, так и возможности для получения многоцветных изображений. К настоящему времени появились три стратегии: возбуждение спектрально разделенных флуорофоров с помощью светоделителя излучения, использование нескольких активаторов / репортеров в режиме STORM и ратиометрическое отображение спектрально близких флуорофоров.
Хотя изначально PALM и STORM были разработаны как методы визуализации 2D (x, y), они быстро превратились в методы, поддерживающие 3D (x, y, z). Для определения осевого положения одиночного флуорофора в образце в настоящее время используются следующие подходы: модификация функции рассеяния точки для введения z-зависимых особенностей в 2D (x, y) изображение (наиболее распространенный подход - ввести астигматизм в PSF); многоплоскостное обнаружение, где осевое положение определяется путем сравнения двух изображений одного и того же PSF, расфокусированных одно относительно другого; интерферометрическое определение осевого положения излучателя с использованием двух противоположных объективов и нескольких детекторов; использование для ограничения возбуждения / активации; использование светового листа возбуждение / активация для ограничения слоем толщиной в несколько сотен нанометров, произвольно расположенным вдоль z-плоскости внутри образца.
Требование нескольких циклов активации, возбуждения и деактивации / отбеливания обычно подразумевает длительные периоды времени для формирования изображения ЛАДОНИ / ШТОРМЫ и, следовательно, операции на фиксированный образец. Еще в 2007 году был опубликован ряд работ, в которых PALM / STORM исследовался на живых клетках. Возможность получения изображений в реальном времени с высоким разрешением с использованием этих методов в конечном итоге зависит от технических ограничений сбора достаточного количества фотонов от одного излучателя за очень короткое время. Это зависит как от фотофизических ограничений зонда, так и от чувствительности используемого детектора. Относительно медленные (от секунд до десятков секунд) процессы, такие как модификация организации фокальных спаек, были исследованы с помощью PALM, тогда как STORM позволил визуализировать более быстрые процессы, такие как мембранная диффузия ямок, покрытых клатрином или процессы митохондриального деления / слияния. Перспективным применением PALM живых клеток является использование фотоактивации для выполнения отслеживания одиночных частиц с высокой плотностью (sptPALM), преодолевая традиционное ограничение отслеживания одиночных частиц для работы с системами, отображающими очень низкую концентрацию флуорофоров..
Хотя традиционные измерения PALM и STORM используются для определения физической структуры образца, причем интенсивности флуоресцентных событий определяют достоверность локализации, эти интенсивности также можно использовать для отображения взаимодействий флуорофора с нанофотонными структурами. Это было выполнено как на металлических (плазмонных ) структурах, таких как золотые наностержни, так и на полупроводниковых структурах, таких как кремниевые нанопроволоки. Эти подходы могут быть использованы либо для флуорофоров, функционализированных на поверхности исследуемого образца (как для упомянутых здесь исследований плазмонных частиц), либо для случайной адсорбции на подложке, окружающей образец, что позволяет полностью 2D-картировать взаимодействия флуорофор-наноструктура во всех положениях. относительно структуры.
Эти исследования показали, что, помимо стандартной неопределенности локализации из-за подгонки функции рассеяния точки, самоинтерференция света, рассеянного наночастицами, может привести к искажения или смещения отображаемых функций разброса точек, затрудняющие анализ таких измерений. Однако их можно ограничить, например, путем включения метаповерхностных масок, которые контролируют разрешенное угловое распределение света в системе измерения.
PALM и STORM имеют общий общий фундаментальный принцип, и многочисленные разработки сделали эти две техники еще более взаимосвязанными. Тем не менее, они отличаются некоторыми техническими деталями и принципиальным моментом. С технической стороны, PALM выполняется на биологическом образце с использованием флуорофоров, экзогенно экспрессируемых в форме генетических конструкций слияния с фотоактивируемым флуоресцентным белком. Вместо этого STORM использует иммуномаркирование эндогенных молекул в образце антителами, меченными органическими флуорофорами. В обоих случаях флуорофоры переводятся между активным включенным и неактивным состоянием с помощью света. В PALM, однако, фотоактивация и фотообесцвечивание ограничивают жизнь флуорофора ограниченным интервалом времени, и желательно непрерывное излучение флуорофора между ними без какой-либо перемежающейся флуоресценции. В стохастическом STORM фотомигание органических флуорофоров (обычно более ярких, чем флуоресцентные белки) первоначально использовалось для разделения соседних красителей. В этом отношении, чем сильнее мигание, тем выше вероятность различения двух соседних флуорофоров.
В этом отношении в нескольких исследовательских работах изучалась способность PALM выполнять количественное определение количества флуорофоров (и, следовательно, представляющих интерес белков), присутствующих в образце, путем подсчета активированных флуорофоров. Подход, используемый для обработки флуоресцентной динамики флуоресцентной метки, используемой в экспериментах, будет определять окончательный вид изображения сверхвысокого разрешения и возможность определения однозначного соответствия между событием локализации и белком в образце.
Воспроизвести медиа Иммобилизованные флуоресцентные белки фотоактивированы, возбуждены и обесцвечены
Воспроизвести медиа Динамическое отображение дендритных шипов в сверхвысоком разрешении с использованием низкоаффинного фотопреобразователя актина.
Воспроизвести media Исследование динамики актина спинного мозга в нейронах гиппокампа крыс с помощью оптической микроскопии сверхвысокого разрешения
