Войти
S. cerevisiae, выявленные с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием флуоресцентного мечения В молекулярной биологии и биотехнологии, флуоресцентная метка, также известная как флуоресцентная метка или флуоресцентный зонд представляет собой молекулу, которая присоединена химически для помощи в обнаружении биомолекулы, такой как белок, антитело или аминокислота. Обычно для флуоресцентного мечения или мечения используется реактивное производное флуоресцентной молекулы, известное как флуорофор. Флуорофор избирательно связывается с определенной областью или функциональной группой на молекуле-мишени и может быть присоединен химически или биологически. Широко используются различные методы маркировки, такие как ферментативная маркировка, маркировка белков и генетическая маркировка. Бромид этидия, флуоресцеин и зеленый флуоресцентный белок являются общими тегами. Наиболее часто мечеными молекулами являются антитела, белки, аминокислоты и пептиды, которые затем используются в качестве специфических зондов для обнаружения конкретной мишени.
Стоукс Джордж Дж. 
Осаму Шимомура-пресс-конференция 06 декабря 2008-1 Разработка методов обнаружения и идентификации биомолекул была мотивирована возможностью улучшить изучение молекулярной структуры и взаимодействий. До появления флуоресцентного мечения радиоизотопы использовались для обнаружения и идентификации молекулярных соединений. С тех пор были разработаны более безопасные методы, включающие использование флуоресцентных красителей или флуоресцентных белков в качестве меток или зондов в качестве средства для мечения и идентификации биомолекул. Хотя флуоресцентное мечение в этом отношении использовалось только недавно, открытие флуоресценции происходит гораздо дольше.
Сэр Джордж Стоукс разработал закон флуоресценции Стокса в 1852 году, согласно которому длина волны флуоресцентного излучения больше, чем длина волны возбуждающего излучения. Ричард Мейер в 1897 году назвал флуорофор, чтобы описать химическую группу, связанную с флуоресценцией. С тех пор флуоресцеин был создан в качестве флуоресцентного красителя Адольфом фон Байером в 1871 году, а метод окрашивания был разработан и использован с развитием флуоресцентной микроскопии в 1911 году.
Бромид этидия и его варианты были разработаны в 1950-х годах, а в 1994 году были введены флуоресцентные белки или FP. Зеленый флуоресцентный белок или GFP был открыт Осаму Шимомура в 1960-х годах и был была разработана как индикаторная молекула Дугласом Прашером в 1987 году. FP привели к прорыву в области визуализации живых клеток с возможностью выборочно маркировать участки генетического белка и наблюдать за функциями и механизмами белков. За этот прорыв Шимомура был удостоен Нобелевской премии в 2008 году.
Были разработаны новые методы отслеживания биомолекул, включая использование колориметрических биосенсоров, фотохромных соединений, биоматериалов и электрохимических сенсоров. Флуоресцентное маркирование также является распространенным методом, в котором применяются ферментативные метки, химические метки, метки белков и генетические метки.
Типы биосенсоров В настоящее время существует несколько методов маркировки биомолекул. Некоторые из методов включают следующее.
Обычные виды, для которых используются изотопные маркеры, включают белки. В этом случае аминокислоты со стабильными изотопами углерода, азота или водорода включаются в полипептидные последовательности. Затем эти полипептиды подвергаются масс-спектрометрии. Из-за точно определенного изменения, которое эти изотопы вызывают в пептидах, по графику спектрометрии можно определить, какие пептиды содержат изотопы. Таким образом можно извлечь интересующий белок из нескольких других в группе. Изотопные соединения играют важную роль в качестве фотохромов, описанных ниже.
Биосенсоры прикреплены к интересующему веществу. Обычно это вещество не может поглощать свет, но с присоединенным биосенсором свет может поглощаться и излучаться на спектрофотометре . Кроме того, флуоресцентные биосенсоры можно увидеть невооруженным глазом. Некоторые флуоресцентные биосенсоры также могут изменять цвет в изменяющейся среде (например, с синего на красный). Исследователь сможет исследовать и получать данные об окружающей среде на основе того, какой цвет он или она может видеть визуально у гибридных видов биосенсора и молекулы.
Колориметрические анализы обычно используются для определения того, сколько концентрации одного
Фотохромные соединения обладают способностью переключаться между диапазоном или множеством цветов. Их способность отображать разные цвета зависит от того, как они поглощают свет. Различные изомерные проявления молекулы поглощают свет с разной длиной волны, так что каждый изомерный вид может отображать свой цвет в зависимости от своего поглощения. К ним относятся соединения с фотопереключением, которые представляют собой белки, которые могут переключаться из нефлуоресцентного состояния в состояние флуоресценции в определенных условиях.
Наиболее распространенной органической молекулой, которая используется в качестве фотохрома, является диарилетен.. Другие примеры фотосопереключаемых белков включают PADRON-C, rs-FastLIME-s и bs-DRONPA-s, которые можно использовать как в клетках растений, так и в клетках млекопитающих, чтобы наблюдать, как клетки перемещаются в различные среды.
Флуоресцентные биоматериалы - это возможный способ использования внешних факторов для более заметного наблюдения за путем. Метод включает флуоресцентное маркирование пептидных молекул, которые могут изменить естественный путь организма. Когда этот пептид вводится в клетку организма, он может вызвать другую реакцию. Этот метод можно использовать, например, для лечения пациента, а затем для визуального наблюдения за результатом лечения.
Электрохимические датчики могут использоваться для определения биомолекул без маркировки. Они обнаруживают изменения и измеряют ток между исследуемым металлическим электродом и электролитом, содержащим целевой аналит. Затем к электроду прикладывается известный потенциал от тока обратной связи, и результирующий ток может быть измерен. Например, один метод с использованием электрохимического зондирования включает медленное повышение напряжения, вызывающее окисление или восстановление химических веществ на электроде. График зависимости тока ячейки от напряжения позволяет в конечном итоге определить количество химических веществ, потребляемых или производимых на электроде. Флуоресцентные метки можно использовать в сочетании с электрохимическими датчиками для облегчения обнаружения в биологической системе.
Aequorea victoria 
Структура GFP Из различных методов мечения биомолекул флуоресцентные метки имеют преимущество в том, что они очень чувствительны даже при низкой концентрации и не разрушают мишень сворачивание и функция молекул.
Зеленый флуоресцентный белок - это встречающийся в природе флуоресцентный белок из медузы Aequorea victoria, который широко используется для маркировки интересующих белков. GFP излучает фотон в зеленой области светового спектра при возбуждении за счет поглощения света. Хромофор состоит из окисленного трипептида -Ser ^ 65-Tyr ^ 66-Gly ^ 67, расположенного внутри β-цилиндра. GFP катализирует окисление и требует только молекулярного кислорода. GFP был изменен путем изменения длины волны поглощаемого света для включения других цветов флуоресценции. YFP или желтый флуоресцентный белок, BFP или синий флуоресцентный белок и CFP или голубой флуоресцентный белок являются примерами вариантов GFP. Эти варианты получены с помощью генной инженерии гена GFP.
Синтетические флуоресцентные зонды также могут использоваться в качестве флуоресцентных меток. Преимущества этих этикеток включают меньший размер и большее разнообразие цветов. Их можно использовать для более селективной маркировки представляющих интерес белков с помощью различных методов, включая маркировку на основе химического распознавания, такую как использование хелатирующих металлы пептидных меток, и маркировку на основе биологического распознавания с использованием ферментативных реакций. Однако, несмотря на широкий спектр длин волн возбуждения и излучения, а также лучшую стабильность, синтетические зонды, как правило, токсичны для клетки и поэтому обычно не используются в исследованиях визуализации клеток.
Флуоресцентные метки можно гибридизировать с мРНК чтобы помочь визуализировать взаимодействие и активность, например локализацию мРНК. Антисмысловая цепь, меченная флуоресцентным зондом, присоединяется к одной цепи мРНК, и затем ее можно рассматривать во время развития клетки, чтобы увидеть движение мРНК внутри клетки.
Флуороген представляет собой лиганд (флуорогенный лиганд), который сам по себе не является флуоресцентным, но когда он связан с конкретным белком или структура РНК становится флуоресцентной.
Например, FAST является вариантом фотоактивный белок желтого цвета, который был разработан для связывания химических имитаторов трипептидного хромофора GFP. Аналогичным образом аптамер шпината представляет собой сконструированную последовательность РНК, которая может связывать химические имитаторы хромофора GFP, тем самым обеспечивая условную и обратимую флуоресценцию молекулам РНК, содержащим последовательность.
В тесте с прямым флуоресцентным антителом антитела были химически связаны с флуоресцентным красителем 
FISH-изображение бифидобактерий Cy3 
FISH-анализ синдром Ди Джорджи Флуоресцентная маркировка известна своей неразрушающей природой и высокой чувствительностью. Это сделало его одним из наиболее широко используемых методов маркировки и отслеживания биомолекул. В зависимости от природы мишени можно использовать несколько методов флуоресцентного мечения.
При ферментативном мечении сначала формируется конструкция ДНК с использованием гена и ДНК флуоресцентного белка. После транскрипции образуется гибрид РНК + флуоресцентный. Интересующий объект прикреплен к ферменту, который может распознавать эту гибридную ДНК. Обычно в качестве флуорофора используется флуоресцеин или биотин.
Химическая маркировка или использование химических меток использует взаимодействие между небольшой молекулой и конкретной генетической аминокислотной последовательностью. Химическая маркировка иногда используется в качестве альтернативы GFP. Синтетические белки, которые функционируют как флуоресцентные зонды, меньше, чем у GFP, и поэтому могут функционировать как зонды в более разнообразных ситуациях. Кроме того, они предлагают более широкий диапазон цветов и фотохимических свойств. В связи с недавними достижениями в области химической маркировки, химические метки предпочтительнее флуоресцентных белков из-за архитектурных и размерных ограничений характерного β-цилиндра флуоресцентного белка. Изменения флуоресцентных белков могут привести к потере флуоресцентных свойств.
Мечение белков использует короткий тег, чтобы минимизировать нарушение укладки и функции белка. Переходные металлы используются для связывания определенных остатков в метках с сайт-специфическими мишенями, такими как N-концы, C-концы или внутренние сайты внутри белка. Примеры тегов, используемых для маркировки белков, включают биомышьяковые теги, гистидиновые теги и теги FLAG.
Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) является примером метода генетической маркировки, в котором используется зонды, специфичные для участков хромосомы по длине хромосомы, также известные как окраска хромосомы. Множественные флуоресцентные красители, каждый из которых имеет различную длину волны возбуждения и излучения, связываются с зондом, который затем гибридизуется с хромосомами. Флуоресцентный микроскоп может обнаруживать присутствующие красители и отправлять их на компьютер, который может выявить кариотип клетки. Этот метод позволяет выявлять аномалии, такие как делеции и дупликации.
Химические метки были адаптированы для технологий визуализации больше, чем флуоресцентные белки, потому что химические метки могут локализовать фотосенсибилизаторы ближе к цели белки. Затем белки могут быть помечены и обнаружены с помощью визуализации, такой как микроскопия сверхвысокого разрешения, Ca-визуализация, определение pH, обнаружение перекиси водорода, хромофорная световая инактивация и многофотонная световая микроскопия.. Исследования изображений in vivo на живых животных были выполнены впервые с использованием мономерного белка, полученного из бактериальной галогеналкандегалогеназы, известной как Halo-tag. Halo-tag ковалентно связывается со своим лигандом и обеспечивает лучшую экспрессию растворимых белков.
Хотя флуоресцентные красители могут не иметь такая же чувствительность, как и у радиоактивных зондов, позволяет в реальном времени отображать активность молекул в действии. Более того, радиация и надлежащее обращение больше не являются проблемой.
С развитием флуоресцентного мечения флуоресцентная микроскопия позволила визуализировать специфические белки как на фиксированных, так и на живых изображениях клеток. Локализация определенных белков привела к появлению важных концепций в клеточной биологии, таких как функции отдельных групп белков в клеточных мембранах и органеллах. При визуализации живых клеток флуоресцентные метки позволяют отслеживать перемещения белков и их взаимодействия.
Последние достижения в методах, использующих флуоресцентные метки, привели к визуализации мРНК и ее локализации в различных организмах. Визуализация РНК в живых клетках может быть достигнута путем введения синтезированной РНК, которая химически связана с флуоресцентной меткой, в живые клетки с помощью микроинъекции. Этот метод был использован, чтобы показать, как мРНК oskar в эмбрионе Drosophila локализуется в задней области ооцита.
