Войти
Визуализация кальция - это метод микроскопии для оптического измерения кальциевого (Ca) статуса изолированной клетки, ткани или средний. Визуализация кальция использует индикаторы кальция, флуоресцентные молекулы, которые реагируют на связывание ионов Са, изменяя свои флуоресцентные свойства. Существует два основных класса индикаторов кальция: химические индикаторы и генетически кодируемые индикаторы кальция (GECI). Этот метод позволил изучить передачу сигналов кальция в самых разных типах клеток. В нейронах электрическая активность всегда сопровождается притоком ионов Са. Таким образом, визуализация кальция может использоваться для мониторинга электрической активности сотен нейронов в клеточной культуре или у живых животных, что позволило проанализировать функцию нейронных цепей.
Схема типичной установки для кальциевой флуоресцентной визуализации изолированных сердечных миоцитов Химические индикаторы небольшие молекулы, которые могут хелатировать ионы кальция. Все эти молекулы основаны на гомологе EGTA, называемом BAPTA, с высокой селективностью по ионам кальция (Ca) по сравнению с ионами магния (Mg).
В эту группу индикаторов входят фура-2, индо-1, флуо-3, флуо-4, Кальций Зеленый-1.
Эти красители часто используются с хелатирующими карбоксильными группами, замаскированными как ацетоксиметил сложные эфиры, чтобы сделать молекулу липофильной и облегчить проникновение в клетку. Как только индикатор в этой форме находится в клетке, клеточные эстеразы освобождают карбоксильные группы, и индикатор сможет связывать кальций. Свободная кислотная форма красителей (то есть без модификации ацетоксиметилового эфира) также может быть непосредственно введена в клетки через микроэлектрод или микропипетку, что устраняет неопределенности относительно клеточного компартмента, содержащего краситель. (Ацетоксиметиловый эфир может также проникать в эндоплазматический ретикулум и митохондрии ). Связывание иона Са с молекулой флуоресцентного индикатора приводит либо к увеличению квантового выхода флуоресценции, либо к сдвигу длины волны излучения / возбуждения. Индивидуальные химические флуоресцентные индикаторы Ca используются для измерения цитозольного кальция в самых разных клеточных препаратах. Впервые визуализация Ca в реальном времени (видеоизображение) была проведена в 1986 году в сердечных клетках с использованием усиленных видеокамер. Дальнейшее развитие техники с использованием лазерных сканирующих конфокальных микроскопов позволило выявить субклеточные сигналы Ca в виде искр Ca и бликов Ca. Относительные ответы от комбинации химических флуоресцентных индикаторов Ca также использовались для количественной оценки переходных процессов кальция во внутриклеточных органеллах, таких как митохондрии.
Визуализация кальция, также называемая кальциевым картированием, также используется для проведения исследований ткани миокарда. Картирование кальция - это повсеместный метод, используемый для целых изолированных сердец, таких как мыши, крысы и кролики.
Эти индикаторы представляют собой флуоресцентные белки, полученные из зеленого флуоресцентного белка (GFP) или его вариантов (например, GFP, YFP, CFP с круговой перестановкой), слитых с кальмодулином (CaM) и доменом M13 киназы легкой цепи миозина, который способен связывать CaM. Альтернативно, варианты GFP сливаются с кальций-связывающим белком тропонином C (TnC), применяя механизм FRET (Förster Resonance Energy Transfer) для модуляции сигнала.
Генетически закодированные индикаторы не нужно загружать в клетки, вместо этого гены, кодирующие эти белки, можно легко трансфицировать в клеточные линии. Также возможно создать трансгенных животных, экспрессирующих краситель во всех клетках или выборочно в определенных клеточных подтипах. GECI использовались в исследованиях нейронов, Т-клеток, кардиомиоцитов и т. Д.
| GECI | Year | Sensing | Отчетность | Предшественник |
|---|---|---|---|---|
| Cameleons | 1997 | Кальмодулин | Пара FRET: BFP или CFP и GFP или YFP | - |
| FIP-CB SM | 1997 | Кальмодулин | Пара FRET: BFP и RFP | - |
| Pericams | 2000 | Кальмодулин | cpGFP | - |
| GCaMP | 2000 | Кальмодулин | cpEGFP | - |
| TN-L15 | 2004 | Модифицированный тропонин C скелетных мышц курицы | Пара FRET: YFP (цитрин) и CFP (Cerulean) | - |
| TN-humTnC | 2004 | Сердечный тропонин C человека | Пара FRET: YFP (цитрин) и CFP (Cerulean) | - |
| TN-XL | 2006 | Модифицированный тропонин C скелетных мышц цыпленка | Пара FRET: пермутированные YFP (цитрин) и CFP (Cerulean) | TN-L15 |
| TN-XXL | 2008 | Модифицированный csTnC в TN-XL | пара FRET: пермутированные YFP (цитрин) и CFP (Cerulean) | TN-XL |
| Twitch's | 2014 | Тропонин C | Пара FRET (различные из двух FP) | - |
| RCaMP1 | 2013 | Кальмодулин | mRuby (красный FP) | - |
| jRGECO1a | 2016 | Кальмодулин | mApple (красный FP) | R-GECO |
Специальный класс генетически кодируемых индикаторов кальция разработан для формирования постоянной флуоресцентной метки в активных нейронах. Они основаны на фотопереключаемом белке mEos, который меняет цвет с зеленого на красный при освещении фиолетовым светом. В сочетании с датчиком кальция кальмодулином фиолетовый свет фотопреобразует только нейроны с повышенным уровнем кальция. SynTagMA - это версия CaMPARI2, ориентированная на синапсы.
| GECI | Год | Исследование | Отчетность | Предшественник |
|---|---|---|---|---|
| CaMPARI | 2015 | Кальмодулин + фиолетовый свет | mEos: преобразование зеленого в красный | - |
| CaMPARI2 | 2018 | Кальмодулин + фиолетовый свет | mEos: преобразование зеленого в красный | CaMPARI |
| SynTagMA | 2020 | Кальмодулин + фиолетовый свет | mEos: преобразование зеленого в красный | CaMPARI2 |
Независимо от типа используемого индикатора, процедура визуализации в целом очень похожа. Клетки, наполненные индикатором или экспрессирующие его в случае GECI, можно рассматривать с помощью флуоресцентного микроскопа и фиксировать с помощью камеры Scientific CMOS (sCMOS) или камеры CCD. Конфокальные и двухфотонные микроскопы обеспечивают возможность оптического сечения, так что кальциевые сигналы могут быть разделены в микродоменах, таких как дендритные шипы или синаптические бутоны даже в толстых образцах, таких как мозг млекопитающих. Изображения анализируются путем измерения изменений интенсивности флуоресценции для одной длины волны или двух длин волн, выраженных в виде отношения (ратиометрические показатели). При необходимости полученные значения интенсивности и соотношения флуоресценции могут быть нанесены на график против откалиброванных значений для известных уровней Са для измерения абсолютных концентраций Са. Методы световой микроскопии расширяют функциональное считывание возможностей нервной активности в трехмерных объемах.
