Фёрстеровский резонансный перенос энергии

редактировать

Диаграмма Яблонского FRET с указанием типичных временных масштабов. Обратите внимание, что черная пунктирная линия обозначает виртуальный фотон.

Фёрстера или флуоресцентный резонансный перенос энергии ( FRET), резонансный перенос энергии ( RET) или электронный перенос энергии ( EET) - это механизм, описывающий перенос энергии между двумя светочувствительными молекулами ( хромофорами ). Донорный хромофор, первоначально находящийся в возбужденном электронном состоянии, может передавать энергию акцепторному хромофору посредством безызлучательного диполь-дипольного взаимодействия. Эффективность этой передачи энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором, что делает FRET чрезвычайно чувствительным к небольшим изменениям расстояния.

Измерения эффективности FRET можно использовать, чтобы определить, находятся ли два флуорофора на определенном расстоянии друг от друга. Такие измерения используются в качестве инструмента исследования в таких областях, как биология и химия.

FRET аналогичен связи ближнего поля в том смысле, что радиус взаимодействия намного меньше длины волны излучаемого света. В ближней зоне возбужденный хромофор испускает виртуальный фотон, который мгновенно поглощается принимающим хромофором. Эти виртуальные фотоны невозможно обнаружить, поскольку их существование нарушает закон сохранения энергии и импульса, и, следовательно, FRET известен как безызлучательной механизм. Квантовые электродинамические расчеты были использованы для определения того, что безызлучательный (FRET) и радиационный перенос энергии являются короткодействующими и дальнодействующими асимптотами единого единого механизма.

СОДЕРЖАНИЕ

1 Терминология
2 Теоретическая основа
3 Экспериментальное подтверждение теории резонансного переноса энергии Фёрстера
4 Методы измерения эффективности FRET
- 4.1 Сенсибилизированное излучение
- 4.2 Фотообесцвечивание FRET
- 4.3 Измерения срока службы
5 флуорофоров, используемых для FRET
- 5.1 Пары CFP-YFP
- 5.2 BRET
- 5.3 Гомо-FRET
- 5.4 Другое
6 приложений
- 6.1 Белки
- 6.2 Мембраны
- 6.3 Хемосенсор
- 6.4 Пути передачи сигналов
- 6.5 Другие приложения
7 Другие методы
8 См. Также
9 ссылки
10 Внешние ссылки

Терминология

Мультяшная диаграмма концепции резонансной передачи энергии Фёрстера (FRET).

Фёрстеровский резонансный перенос энергии назван в честь немецкого учёного Теодора Фёрстера. Когда оба хромофора являются флуоресцентными, вместо этого часто используется термин «резонансный перенос энергии флуоресценции», хотя на самом деле энергия не передается посредством флуоресценции. Чтобы избежать ошибочной интерпретации явления, которое всегда представляет собой безызлучательный перенос энергии (даже когда происходит между двумя флуоресцентными хромофорами), название «резонансный перенос энергии Фёрстера» предпочтительнее, чем «резонансный перенос энергии флуоресценции»; однако последний широко используется в научной литературе. FRET не ограничивается флуоресценцией и также возникает в связи с фосфоресценцией.

Теоретические основы

Эффективность FRET () - это квантовый выход перехода с передачей энергии, то есть вероятность события передачи энергии, происходящего на событие возбуждения донора: ${\ displaystyle E}$ $E$

{\ displaystyle E = {\ frac {k _ {\ text {ET}}} {k_ {f} + k _ {\ text {ET}} + \ sum {k_ {i}}}},}

{\ displaystyle E = {\ frac {k _ {\ text {ET}}} {k_ {f} + k _ {\ text {ET}} + \ sum {k_ {i}}}},}

где - скорость передачи энергии, скорость радиационного распада донора и скорости любых других путей девозбуждения, исключая передачу энергии другим акцепторам. ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$ ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$ ${\ displaystyle k_ {f}}$ $k_f$ ${\ displaystyle k_ {i}}$ $k_ {i}$

Эффективность FRET зависит от многих физических параметров, которые можно сгруппировать как: 1) расстояние между донором и акцептором (обычно в диапазоне 1–10 нм), 2) спектральное перекрытие спектра излучения донора и поглощения акцептора. спектр ; 3) взаимная ориентация дипольного момента испускания донора и дипольного момента поглощения акцептора.

${\ displaystyle E}$ $E$ зависит от расстояния от донора до акцептора с обратным законом 6-й степени из-за механизма диполь-дипольного взаимодействия: ${\ displaystyle r}$ $р$

{\ displaystyle E = {\ frac {1} {1+ (r / R_ {0}) ^ {6}}}}

{\ displaystyle E = {\ frac {1} {1+ (r / R_ {0}) ^ {6}}}}

где расстояние Ферстера этой пары донора и акцептора, то есть расстояние, на котором эффективность передачи энергии составляет 50%. Расстояние Ферстера зависит от интеграла перекрытия спектра излучения донора со спектром поглощения акцептора и их взаимной молекулярной ориентации, что выражается следующим уравнением: ${\ displaystyle R_ {0}}$ $R_ {0}$

{\ displaystyle {R_ {0}} ^ {6} = {\ frac {2.07} {128 \, \ pi ^ {5} \, N_ {A}}} \, {\ frac {\ kappa ^ {2} \, Q_ {D}} {n ^ {4}}} {\ int F _ {\ rm {D}} (\ lambda) \, \ epsilon _ {\ rm {A}} (\ lambda) \, \ lambda ^ {4} \, d \ lambda}}

{R_ {0}} ^ {6} = {\ frac {2.07} {128 \, \ pi ^ {5} \, N_ {A}}} \, {\ frac {\ kappa ^ {2} \, Q_ {D}} {n ^ {4}}} {\ int F _ {\ rm {D}} (\ lambda) \, \ epsilon _ {\ rm {A}} (\ lambda) \, \ lambda ^ {4 } \, d \ lambda}

где - квантовый выход флуоресценции донора в отсутствие акцептора, - фактор ориентации диполя, - показатель преломления среды, - постоянная Авогадро, - интеграл спектрального перекрытия, рассчитанный как ${\ displaystyle Q _ {\ text {D}}}$ ${\ displaystyle Q _ {\ text {D}}}$ ${\ Displaystyle \ каппа ^ {2}}$ $\ каппа ^ {2}$ ${\ displaystyle n}$ $п$ ${\ displaystyle N _ {\ text {A}}}$ $N _ {{\ text {A}}}$ ${\ displaystyle J}$ $J$

{\ displaystyle J = {\ frac {\ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A}} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda} { \ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \, d \ lambda}} = \ int {\ overline {f _ {\ text {D}}}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A }} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda,}

{\ displaystyle J = {\ frac {\ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A}} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda} { \ int f _ {\ text {D}} (\ lambda) \, d \ lambda}} = \ int {\ overline {f _ {\ text {D}}}} (\ lambda) \ epsilon _ {\ text {A }} (\ lambda) \ lambda ^ {4} \, d \ lambda,}

где - спектр излучения донора, - спектр излучения донора, нормированный на область, равную 1, и - коэффициент молярной экстинкции акцептора, обычно получаемый из спектра поглощения. Фактор ориентации κ определяется выражением ${\ displaystyle f _ {\ text {D}}}$ ${\ displaystyle f _ {\ text {D}}}$ ${\ Displaystyle {\ overline {е _ {\ текст {D}}}}}$ ${\ Displaystyle {\ overline {е _ {\ текст {D}}}}}$ ${\ displaystyle \ epsilon _ {\ text {A}}}$ ${\ displaystyle \ epsilon _ {\ text {A}}}$

{\ displaystyle \ kappa = {\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {\ mu}} _ {\ text {D}} - 3 ({\ hat {\ mu} } _ {\ text {D}} \ cdot {\ hat {R}}) ({\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {R}}),}

{\ displaystyle \ kappa = {\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {\ mu}} _ {\ text {D}} - 3 ({\ hat {\ mu} } _ {\ text {D}} \ cdot {\ hat {R}}) ({\ hat {\ mu}} _ {\ text {A}} \ cdot {\ hat {R}}),}

где обозначает нормированный дипольный момент перехода соответствующего флуорофора, а обозначает нормированное межфлуорофорное смещение. = 2/3 часто предполагается. Это значение получается, когда оба красителя свободно вращаются, и его можно рассматривать как изотропно ориентированные в течение времени жизни в возбужденном состоянии. Если какой- либо краситель зафиксирован или не может вращаться, то = 2/3 не будет верным предположением. В большинстве случаев, однако, даже небольшая переориентация красителей приводит к достаточному ориентационному усреднению, при котором = 2/3 не приводит к большой ошибке в оценке расстояния передачи энергии из-за зависимости от от шестой степени. Даже когда оно сильно отличается от 2/3, ошибка может быть связана со сдвигом, и, таким образом, определения изменений относительного расстояния для конкретной системы все еще действительны. Флуоресцентные белки не переориентируются во времени, превышающем время жизни их флуоресценции. В этом случае 0 ≤ ≤ 4. ${\ displaystyle {\ hat {\ mu}} _ {i}}$ ${\ hat {\ mu}} _ {i}$ ${\ displaystyle {\ hat {R}}}$ ${\ hat {R}}$ ${\ Displaystyle \ каппа ^ {2}}$ $\ каппа ^ {2}$ ${\ Displaystyle \ каппа ^ {2}}$ $\ каппа ^ {2}$ ${\ Displaystyle \ каппа ^ {2}}$ $\ каппа ^ {2}$ ${\ displaystyle R_ {0}}$ $R_ {0}$ ${\ Displaystyle \ каппа ^ {2}}$ $\ каппа ^ {2}$ ${\ Displaystyle \ каппа ^ {2}}$ $\ каппа ^ {2}$ ${\ displaystyle R_ {0}}$ $R_ {0}$ ${\ Displaystyle \ каппа ^ {2}}$ $\ каппа ^ {2}$

Для зависимого от времени анализа FRET вместо этого можно напрямую использовать скорость передачи энергии (): ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$ ${\ displaystyle k _ {\ text {ET}}}$

{\ displaystyle k _ {\ text {ET}} = ({\ frac {R_ {0}} {r}}) ^ {6} \, {\ frac {1} {\ tau _ {D}}}}

{\ displaystyle k _ {\ text {ET}} = ({\ frac {R_ {0}} {r}}) ^ {6} \, {\ frac {1} {\ tau _ {D}}}}

где - время жизни флуоресценции донора в отсутствие акцептора. ${\ displaystyle \ tau _ {D}}$ $\ tau _ {D}$

Эффективность FRET связана с квантовым выходом и временем жизни флуоресценции донорной молекулы следующим образом:

{\ displaystyle E = 1- \ tau '_ {\ text {D}} / \ tau _ {\ text {D}},}

{\ displaystyle E = 1- \ tau '_ {\ text {D}} / \ tau _ {\ text {D}},}

где и - времена жизни донорной флуоресценции в присутствии и в отсутствие акцептора соответственно, или как ${\ Displaystyle \ тау _ {\ текст {D}} '}$ ${\ Displaystyle \ тау _ {\ текст {D}} '}$ ${\ Displaystyle \ тау _ {\ текст {D}}}$ ${\ Displaystyle \ тау _ {\ текст {D}}}$

{\ displaystyle E = 1-F _ {\ text {D}} '/ F _ {\ text {D}},}

{\ displaystyle E = 1-F _ {\ text {D}} '/ F _ {\ text {D}},}

где и - интенсивности флуоресценции донора с акцептором и без акцептора соответственно. ${\ displaystyle F _ {\ text {D}} '}$ ${\ displaystyle F _ {\ text {D}} '}$ ${\ displaystyle F _ {\ text {D}}}$ ${\ displaystyle F _ {\ text {D}}}$

Экспериментальное подтверждение теории резонансного переноса энергии Фёрстера

Обратная зависимость передачи энергии резонанса Фёрстера от расстояния в шестой степени была экспериментально подтверждена Вилчеком, Эдельхохом и Брандом с использованием триптофильных пептидов. Страйер, Хаугланд и Игерабид также экспериментально продемонстрировали теоретическую зависимость резонансной передачи энергии Фёрстера от интеграла перекрытия, используя конденсированный индолостероид в качестве донора и кетон в качестве акцептора. Однако было обнаружено множество противоречий специальных экспериментов с теорией. Причина в том, что теория носит приблизительный характер и дает завышенные расстояния в 50–100 Ангстремов.

Методы измерения эффективности FRET

В флуоресцентной микроскопии, флуоресцентной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, а также в молекулярной биологии FRET является полезным инструментом для количественной оценки молекулярной динамики в биофизике и биохимии, такой как взаимодействия белок-белок, взаимодействия белок- ДНК и конформационные изменения белка. Для наблюдения за образованием комплекса между двумя молекулами одна из них помечена донором, а другая - акцептором. Эффективность FRET измеряется и используется для идентификации взаимодействий между мечеными комплексами. Существует несколько способов измерения эффективности FRET путем отслеживания изменений флуоресценции, испускаемой донором или акцептором.

Сенсибилизированное излучение

Одним из методов измерения эффективности FRET является измерение изменения интенсивности излучения акцептора. Когда донор и акцептор находятся рядом (1–10 нм) из-за взаимодействия двух молекул, эмиссия акцептора будет увеличиваться из-за межмолекулярного FRET от донора к акцептору. Для мониторинга конформационных изменений белка целевой белок помечается донором и акцептором в двух локусах. Когда скручивание или изгиб белка приводит к изменению расстояния или относительной ориентации донора и акцептора, наблюдается изменение FRET. Если молекулярное взаимодействие или изменение конформации белка зависит от связывания лиганда, этот метод FRET применим к флуоресцентным индикаторам для обнаружения лиганда.

Фотообесцвечивание FRET

Об эффективности FRET можно также судить по скорости фотообесцвечивания донора в присутствии и в отсутствие акцептора. Этот метод можно использовать на большинстве флуоресцентных микроскопов; один просто направляет возбуждающий свет (с частотой, которая будет возбуждать донор, но не акцептор в значительной степени) на образцы с акцепторным флуорофором и без него и отслеживает флуоресценцию донора (обычно отделенную от флуоресценции акцептора с помощью полосового фильтра ) во времени. Шкала времени соответствует фотообесцвечиванию, которая составляет от секунд до минут, при этом флуоресценция на каждой кривой определяется выражением

{\ displaystyle {\ text {background}} + {\ text {constant}} \ cdot e ^ {- {\ text {time}} / \ tau _ {\ text {pb}}},}

{\ displaystyle {\ text {background}} + {\ text {constant}} \ cdot e ^ {- {\ text {time}} / \ tau _ {\ text {pb}}},}

где - постоянная времени затухания фотообесцвечивания и зависит от наличия акцептора. Поскольку фотообесцвечивание заключается в постоянной инактивации возбужденных флуорофоров, резонансная передача энергии от возбужденного донора к акцепторному флуорофору предотвращает фотообесцвечивание этого донорного флуорофора, и, таким образом, высокая эффективность FRET приводит к более длительной постоянной времени затухания фотообесцвечивания: ${\ Displaystyle \ тау _ {\ текст {pb}}}$ ${\ Displaystyle \ тау _ {\ текст {pb}}}$

{\ displaystyle E = 1- \ tau _ {\ text {pb}} / \ tau _ {\ text {pb}} ',}

{\ displaystyle E = 1- \ tau _ {\ text {pb}} / \ tau _ {\ text {pb}} ',}

где и - постоянные времени затухания фотообесцвечивания донора в присутствии и в отсутствие акцептора соответственно. (Обратите внимание, что эта дробь является обратной величиной, используемой для измерения срока службы). ${\ displaystyle \ tau _ {\ text {pb}} '}$ ${\ displaystyle \ tau _ {\ text {pb}} '}$ ${\ Displaystyle \ тау _ {\ текст {pb}}}$ ${\ Displaystyle \ тау _ {\ текст {pb}}}$

Этот метод был введен Джовином в 1989 году. Его использование всей кривой точек для извлечения постоянных времени может дать ему преимущество в точности по сравнению с другими методами. Кроме того, тот факт, что измерения времени выполняются за секунды, а не за наносекунды, упрощает измерение времени жизни флуоресценции, а поскольку скорость затухания фотообесцвечивания обычно не зависит от концентрации донора (если только насыщение акцептора не является проблемой), тщательный контроль концентраций, необходимый для интенсивности замеры не нужны. Однако важно поддерживать одинаковую освещенность для измерений без акцептора и без акцептора, поскольку фотообесцвечивание заметно усиливается при более интенсивном падающем свете.

Измерения срока службы

Эффективность FRET также можно определить по изменению времени жизни флуоресценции донора. Время жизни донора будет уменьшаться в присутствии акцептора. Измерения времени жизни FRET-донора используются в микроскопии визуализации времени жизни флуоресценции (FLIM).

Флуорофоры, используемые для FRET

Если линкер не поврежден, возбуждение на длине волны поглощения CFP (414 нм) вызывает излучение YFP (525 нм) из-за FRET. Если линкер расщепляется протеазой, FRET отменяется, и излучение происходит на длине волны CFP (475 нм).

Пары CFP-YFP

Одной из распространенных пар флуорофоров для биологического использования является пара голубой флуоресцентный белок (CFP) - желтый флуоресцентный белок (YFP). Оба являются цветными вариантами зеленого флуоресцентного белка (GFP). Мечение органическими флуоресцентными красителями требует очистки, химической модификации и внутриклеточной инъекции белка-хозяина. Варианты GFP могут быть прикреплены к белку-хозяину с помощью генной инженерии, что может быть более удобным. Кроме того, слияние CFP и YFP («тандем-димер»), связанных последовательностью расщепления протеазой, можно использовать в качестве анализа расщепления.

BRET

Ограничением FRET, выполняемого с донорами флуорофора, является требование внешнего освещения для инициирования передачи флуоресценции, что может привести к фоновому шуму в результате прямого возбуждения акцептора или к фотообесцвечиванию. Чтобы избежать этого недостатка, был разработан резонансный перенос энергии биолюминесценции (или BRET). В этом методе используется биолюминесцентная люцифераза (обычно люцифераза из Renilla reniformis ), а не CFP, чтобы произвести начальное излучение фотонов, совместимое с YFP.

BRET также был реализован с использованием другого фермента люциферазы, созданного из глубоководной креветки Oplophorus gracilirostris. Эта люцифераза меньше (19 кДа) и ярче, чем более широко используемая люцифераза из Renilla reniformis., И получила название NanoLuc или NanoKAZ. Promega разработала запатентованный субстрат для NanoLuc под названием фуримазин, хотя были опубликованы и другие ценные субстраты коэлентеразина для NanoLuc. Promega разработала версию NanoLuc с расщепленным белком, которая также использовалась в качестве донора BRET в экспериментах по измерению межбелковых взаимодействий.

Homo-FRET

В общем, «FRET» относится к ситуациям, когда донорные и акцепторные белки (или «флуорофоры») относятся к двум различным типам. Однако во многих биологических ситуациях исследователям может потребоваться изучить взаимодействия между двумя или более белками одного типа - или действительно одним и тем же белком с самим собой, например, если белок сворачивается или образует часть полимерной цепи белков или по другим вопросам количественной оценки биологических клеток.

Очевидно, спектральные различия не будут инструментом, используемым для обнаружения и измерения FRET, поскольку и акцепторный, и донорный белок излучают свет с одинаковыми длинами волн. Тем не менее, исследователи могут обнаруживать различия в поляризации между светом, который возбуждает флуорофоры, и светом, который излучается, с помощью метода, называемого визуализацией анизотропии FRET; уровень количественной анизотропии (разница в поляризации между возбуждающим и излучающим пучками) становится индикатором того, сколько событий FRET произошло.

Другие

Различные соединения помимо флуоресцентных белков.

Приложения

Применение флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) значительно расширилось за последние 25 лет, и этот метод стал основным продуктом во многих биологических и биофизических областях. FRET можно использовать в качестве спектроскопической линейки для измерения расстояния и обнаружения молекулярных взаимодействий в ряде систем и находит применение в биологии и биохимии.

Белки

FRET часто используется для обнаружения и отслеживания взаимодействий между белками. Кроме того, FRET можно использовать для измерения расстояний между доменами в одном белке, помечая разные области белка флуорофором и измеряя эмиссию для определения расстояния. Это предоставляет информацию о конформации белка, включая вторичные структуры и укладку белка. Это распространяется на отслеживание функциональных изменений в структуре белка, таких как конформационные изменения, связанные с активностью миозина. Применяемый in vivo, FRET использовался для определения местоположения и взаимодействия клеточных структур, включая интегрины и мембранные белки.

Мембраны

FRET можно использовать для наблюдения за текучестью мембран, движением и распределением мембранных белков, взаимодействием липид-белок и белок-белок в мембране, а также для успешного смешивания различных мембран. FRET также используется для изучения образования и свойств мембранных доменов и липидных рафтов в клеточных мембранах и для определения поверхностной плотности мембран.

Хемосенсор

Зонд на основе FRET, который активируется при взаимодействии с Cd2 +

Зонды на основе FRET могут обнаруживать присутствие различных молекул: на структуру зонда влияет связывание или активность малых молекул, которые могут включать или выключать систему FRET. Это часто используется для обнаружения анионов, катионов, небольших незаряженных молекул, а также некоторых более крупных биомакромолекул. Аналогичным образом, системы FRET были разработаны для обнаружения изменений в клеточной среде из-за таких факторов, как pH, гипоксия или потенциал митохондриальной мембраны.

Сигнальные пути

Еще одно применение FRET - изучение метаболических или сигнальных путей. Например, FRET и BRET использовались в различных экспериментах для характеристики активации рецепторов, связанных с G-белком, и последующих механизмов передачи сигналов. Другие примеры включают использование FRET для анализа таких разнообразных процессов, как бактериальный хемотаксис и активность каспаз при апоптозе.

Другие приложения

Помимо обычных применений, упомянутых ранее, FRET и BRET также эффективны при изучении кинетики биохимических реакций. FRET все чаще используется для мониторинга pH-зависимой сборки и разборки и полезен при анализе нуклеиновых кислот. Этот метод можно использовать для определения факторов, влияющих на различные типы образования наночастиц, а также на механизмы и эффекты наномедицинских препаратов.

Другие методы

Другой, но связанный механизм - перенос электрона по Декстеру.

Альтернативный метод определения близости белок-белок - это бимолекулярная флуоресцентная комплементация (BiFC), при которой две части флуоресцентного белка сливаются с другими белками. Когда эти две части встречаются, они образуют флуорофор на временной шкале в минутах или часах.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки

Эффект FRET в тонком фильме на YouTube
FRET Imaging (Учебное пособие Becker amp; Hickl, веб-сайт)