Войти
Мультиплексная визуализация РНК в клетках с использованием анализов ViewRNA FISH 
Клетка в метафазе, положительная по реаранжировке bcr / abl (связанная с хронический миелолейкоз ) с использованием FISH. Хромосомы можно увидеть синим цветом. Хромосома, помеченная зелеными и красными пятнами (вверху слева), является той, где присутствует перестройка. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH ) - это молекулярный цитогенетический, который использует флуоресцентные зонды, которые связываются только с теми частями последовательности нуклеиновой кислоты с высокой степенью комплементарности последовательности . Он был разработан биомедицинскими исследователями в начале 1980-х годов для обнаружения и локализации наличия или отсутствия конкретных последовательностей ДНК на хромосомах. Флуоресцентная микроскопия может использоваться, чтобы выяснить, где флуоресцентный зонд связан с хромосомами. FISH часто используется для нахождения специфических особенностей ДНК для использования в генетическом консультировании, медицине и идентификации видов. FISH также можно использовать для обнаружения и локализации специфических РНК-мишеней (мРНК, днРНК и миРНК ) в клетках, циркулирующих опухолевых клетках и образцах тканей. В этом контексте это может помочь определить пространственно-временные паттерны экспрессии гена в клетках и тканях.
ViewRNA Обнаружение miR-133 (зеленый) и мРНК миогенина (красный) в дифференцирующихся клетках C2C12 В биологии зонд представляет собой одну цепь ДНК или РНК, которая комплементарен интересующей нуклеотидной последовательности.
РНК-зонды могут быть разработаны для любого гена или любой последовательности в пределах гена для визуализации мРНК, lncRNA и miRNA в тканях и клетках.. FISH используется для изучения цикла клеточного воспроизводства, в частности, интерфазы ядер на предмет любых хромосомных аномалий. FISH позволяет анализировать большую серию архивных случаев, намного проще идентифицировать точно определенную хромосому, создавая зонд с искусственным хромосомным основанием, который будет привлекать похожие хромосомы. Сигналы гибридизации для каждого зонда при обнаружении нуклеиновой аномалии. Каждый зонд для обнаружения мРНК и днРНК состоит из 20 пар олигонуклеотидов, каждая пара занимает пространство 40-50 п.н. Для обнаружения miRNA зонды используют запатентованную химию для специфического обнаружения miRNA и покрывают всю последовательность miRNA.
Уротелиальные клетки, помеченные четырьмя разными зондами. Зонды часто получают из фрагментов ДНК, которые были выделены, очищены и амплифицированы для использования в Human Genome Project. Размер генома человека настолько велик по сравнению с длиной, которую можно было секвенировать напрямую, что пришлось разделить геном на фрагменты. (В конечном итоге эти фрагменты были упорядочены путем переваривания копии каждого фрагмента на еще более мелкие фрагменты с использованием специфичных для последовательности эндонуклеаз, измерения размера каждого небольшого фрагмента с помощью эксклюзионной хроматографии и использования эту информацию, чтобы определить, где большие фрагменты перекрывают друг друга.) Чтобы сохранить фрагменты с их индивидуальными последовательностями ДНК, фрагменты были добавлены в систему постоянно реплицирующихся популяций бактерий. Клональные популяции бактерий, каждая из которых поддерживает единственную искусственную хромосому, хранятся в различных лабораториях по всему миру. Искусственные хромосомы (ВАС ) можно выращивать, извлекать и маркировать в любой лаборатории, содержащей библиотеку. Геномные библиотеки часто называют в честь учреждения, в котором они были разработаны. Примером может служить библиотека RPCI-11, названная в честь Института рака Розуэлл-Парк в Буффало, штат Нью-Йорк. Эти фрагменты имеют порядка 100 тысяч пар оснований и являются основой для большинства FISH-зондов.
клетки, циркулирующие опухолевые клетки (CTCs) или фиксированные формалином залитые парафином (FFPE) или замороженные срезы тканей, затем проницаемость для обеспечения целевой доступности. FISH также успешно проводился на незакрепленных ячейках. Зонд, специфичный для мишени, состоящий из 20 пар олигонуклеотидов, гибридизуется с целевой РНК (ями). Отдельные, но совместимые системы усиления сигнала позволяют проводить мультиплексный анализ (до двух мишеней на анализ). Усиление сигнала достигается с помощью серии последовательных шагов гибридизации. В конце анализа образцы ткани визуализируются под флуоресцентным микроскопом.
Схема принципа эксперимента FISH по локализации гена в ядре. Сначала конструируется зонд. Зонд должен быть достаточно большим для специфической гибридизации со своей мишенью, но не настолько большим, чтобы препятствовать процессу гибридизации. Зонд помечен непосредственно флуорофорами, мишенями для антител или биотином. Маркировка может выполняться различными способами, например, ник-трансляция или Полимеразная цепная реакция с использованием тегированных нуклеотидов.
Затем интерфаза или <Вырабатывается препарат хромосомы 50>метафазы. Хромосомы прочно прикреплены к подложке, обычно к стеклу. Повторяющиеся последовательности ДНК необходимо блокировать путем добавления к образцу коротких фрагментов ДНК. Затем зонд наносят на хромосомную ДНК и инкубируют приблизительно 12 часов при гибридизации. Несколько стадий отмывки удаляют все негибридизированные или частично гибридизированные зонды. Затем результаты визуализируются и количественно оцениваются с помощью микроскопа, который способен возбуждать краситель и записывать изображения.
Если флуоресцентный сигнал слабый, может потребоваться усиление сигнала, чтобы превысить порог обнаружения микроскопа. Сила флуоресцентного сигнала зависит от многих факторов, таких как эффективность маркировки зонда, тип зонда и тип красителя. Флуоресцентно меченые антитела или стрептавидин связаны с молекулой красителя. Эти вторичные компоненты выбраны так, чтобы у них был сильный сигнал.
.
FISH - это очень общий метод. Различия между различными методами FISH обычно связаны с вариациями в последовательности и маркировке зондов; и как они используются в сочетании. Зонды делятся на две общие категории: клеточные и бесклеточные. Под флуоресцентной гибридизацией "in situ" подразумевается размещение зонда в клетке.
Размер зонда важен, потому что более длинные зонды гибридизируются менее специфично, чем более короткие зонды, поэтому короткие цепи ДНК или РНК (часто 10-25 нуклеотидов) которые комплементарны данной целевой последовательности, часто используются для определения местонахождения цели. Перекрытие определяет разрешение обнаруживаемых функций. Например, если целью эксперимента является обнаружение точки останова транслокации, то перекрытие зондов - степень, в которой одна последовательность ДНК содержится в соседних зондах - определяет минимальное окно в который точка останова может быть обнаружена.
Сочетание последовательностей датчиков определяет тип объекта, который может обнаружить датчик. Зонды, которые гибридизуются по всей хромосоме, используются для подсчета количества определенной хромосомы, выявления транслокаций или идентификации внехромосомных фрагментов хроматина. Это часто называют «окраской целых хромосом». Если использовать все возможные зонды, каждая хромосома (весь геном) будет помечена флуоресцентно, что не будет особенно полезно для определения особенностей отдельных последовательностей. Однако можно создать смесь зондов меньшего размера, специфичных для определенного участка (локуса) ДНК; эти смеси используются для обнаружения делеционных мутаций. В сочетании с определенным цветом смесь зондов, специфичных для локуса, используется для обнаружения очень специфических транслокаций. Для подсчета хромосом часто используются специальные смеси локус-специфичных зондов путем связывания с центромерными областями хромосом, которые достаточно различимы для идентификации каждой хромосомы (за исключением хромосомы 13, 14, 21, 22.)
В ряде других методик используются смеси зондов разного цвета. Может быть обнаружен диапазон цветов в смесях флуоресцентных красителей, поэтому каждая хромосома человека может быть идентифицирована по характерному цвету с использованием смесей полных хромосомных зондов и различных соотношений цветов. Хотя хромосом больше, чем легко различимые цвета флуоресцентных красителей, для создания вторичных цветов можно использовать соотношения смесей зондов. Подобно сравнительной геномной гибридизации, смесь зондов для вторичных цветов создается путем смешивания правильного соотношения двух наборов разноокрашенных зондов для одной и той же хромосомы. Этот метод иногда называют M-FISH.
Та же самая физика, которая делает возможным разнообразие цветов для M-FISH, может быть использована для обнаружения транслокаций. То есть кажется, что смежные цвета перекрываются; наблюдается вторичный цвет. Некоторые анализы разработаны таким образом, что вторичный цвет будет присутствовать или отсутствовать в интересующих случаях. Примером может служить обнаружение транслокаций BCR / ABL, где вторичный цвет указывает на заболевание. Этот вариант часто называют FISH двойного слияния или D-FISH. Противоположная ситуация - когда отсутствие вторичного цвета является патологическим - иллюстрируется анализом, используемым для исследования транслокаций, где только одна из точек останова известна или постоянна. Зонды, специфичные для локуса, делают для одной стороны точки останова и другой интактной хромосомы. В нормальных клетках наблюдается вторичный цвет, но при транслокации наблюдаются только основные цвета. Эту технику иногда называют «РЫБОЙ на части».
Одномолекулярная РНК FISH, также известная как Stellaris® RNA FISH, представляет собой метод обнаружения и количественного определения мРНК и других длинных молекул РНК в тонком слое ткани. образец. Мишени могут быть надежно визуализированы путем нанесения множества коротких, однозначно меченных олигонуклеотидных зондов. Связывание до 48 меченых флуоресцентными метками олигонуклеотидов с одной молекулой мРНК обеспечивает достаточную флуоресценцию для точного обнаружения и локализации каждой целевой мРНК на широкоугольном изображении флуоресцентной микроскопии. Зонды, не связывающиеся с намеченной последовательностью, не достигают достаточной локальной флуоресценции, чтобы отличить их от фона.
Анализ одиночной молекулы РНК FISH можно проводить в симплексном или мультиплексном режиме, и их можно использовать в качестве последующий эксперимент для количественной ПЦР или визуализация одновременно с анализом флуоресцентных антител. Эта технология имеет потенциальное применение в диагностике рака, неврологии, анализе экспрессии генов и сопутствующей диагностике.
В технике, альтернативной интерфазной или метафазной подготовке, волокна FISH, интерфазные хромосомы прикрепляются к слайду таким образом, что они вытягиваются по прямой линии, а не туго свертываются, как в обычном FISH. или приняв конформацию территория хромосомы, как в интерфазе FISH. Это достигается путем приложения механического сдвига по длине предметного стекла либо к клеткам, которые были прикреплены к предметному стеклу и затем лизированы, либо к раствору очищенной ДНК. Для этой цели все чаще используется метод, известный как расчесывание хромосом. Расширенная конформация хромосом обеспечивает значительно более высокое разрешение - даже до нескольких килобаз. Подготовка образцов волокон FISH, хотя концептуально проста, является довольно квалифицированным делом, и только специализированные лаборатории используют эту технику на регулярной основе. [Необходима ссылка]
Q-FISH объединяет FISH с PNA и компьютерным программным обеспечением для количественной оценки интенсивности флуоресценции. Этот метод обычно используется в исследованиях длины теломер.
Flow-FISH использует проточную цитометрию для автоматического выполнения FISH с использованием измерений флуоресценции каждой клетки.
Microfluidics-assisted FISH (MA-FISH ) использует микрофлюидный поток для повышения эффективности гибридизации ДНК, снижения расхода дорогостоящих зондов FISH и сокращения времени гибридизации.. MA-FISH применяется для обнаружения гена HER2 в тканях рака молочной железы.
Микроавторадиография FISH - это метод объединения радиоактивно меченых субстратов с традиционным FISH для одновременного обнаружения филогенетических групп и метаболической активности.
Hybrid Fusion FISH (HF-FISH ) использует первичную аддитивную комбинацию возбуждения / испускания флуорофоров для создания дополнительных спектров посредством процесса маркировки, известного как динамический оптическая передача (DOT). Три первичных флуорофора способны генерировать в общей сложности 7 легко обнаруживаемых эмиссионных спектров в результате комбинаторной маркировки с использованием DOT. Hybrid Fusion FISH позволяет использовать много мультиплексные приложения FISH, предназначенные для панелей клинической онкологии. Технология предлагает более быструю оценку с помощью эффективных наборов зондов, которые можно легко обнаружить с помощью традиционных флуоресцентных микроскопов.
Часто родители детей с отклонениями в развитии хотят больше узнать о состоянии своего ребенка, прежде чем решат завести еще одного ребенка. Эти опасения можно решить путем анализа ДНК родителей и ребенка. В случаях, когда нарушение развития ребенка не выяснено, его причину потенциально можно определить с помощью FISH и цитогенетических методов. Примеры заболеваний, которые диагностируются с помощью FISH, включают синдром Прадера-Вилли, синдром Ангельмана, синдром делеции 22q13, хронический миелогенный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, Кри-дю-чат, Велокардиофациальный синдром и синдром Дауна. FISH на сперматозоидах показан мужчинам с аномальным соматическим или мейотическим кариотипом, а также лицам с олигозооспермией, поскольку примерно у 50% мужчин с олигозооспермией наблюдается повышенная скорость хромосомных аномалий сперматозоидов. Анализ хромосом 21, X и Y достаточен для выявления лиц с олигозооспермией в группе риска.
В медицине FISH можно использовать для формирования диагноза, для оценки прогноза, или для оценки ремиссии заболевания, например рака. Затем лечение может быть индивидуализировано. Традиционное обследование, включающее анализ метафазных хромосом, часто не может определить особенности, которые отличают одно заболевание от другого, из-за тонких хромосомных особенностей; FISH может прояснить эти различия. FISH также может использоваться для обнаружения больных клеток более легко, чем стандартные цитогенетические методы, которые требуют деления клеток и требуют трудоемкой ручной подготовки и анализа слайдов технологом. FISH, с другой стороны, не требует живых клеток и может быть определен автоматически, компьютер подсчитывает присутствующие флуоресцентные точки. Однако для того, чтобы различать тонкие различия в образцах полос на изогнутых и скрученных метафазных хромосомах, требуется обученный технолог. FISH может быть встроен в микрофлюидное устройство Lab-on-a-chip. Эта технология все еще находится в стадии разработки, но, как и другие методы лаборатории на чипе, она может привести к созданию более портативных диагностических методов.
Общий процесс флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), используемый для идентификации бактериальных патогенов. Сначала у пациента берут образец инфицированной ткани. Затем синтезируется олигонуклеотид, комплементарный генетическому коду предполагаемого патогена, и химически маркируется флуоресцентным зондом. Образец ткани химически обрабатывают, чтобы сделать клеточные мембраны проницаемыми для флуоресцентно меченного олигонуклеотида. Затем добавляется флуоресцентная метка, которая связывается только с комплементарной ДНК предполагаемого патогена. Если патоген присутствует в образце ткани, то клетки патогена будут флуоресцировать после обработки меченым олигонуклеотидом. Никакие другие клетки не будут светиться. FISH часто используется в клинических исследованиях. Если пациент инфицирован подозреваемым патогеном, бактерии из тканей или жидкостей пациента, как правило, выращивают на агаре для определения идентичности патогена. Однако многие бактерии, даже хорошо известные виды, плохо растут в лабораторных условиях. FISH можно использовать для непосредственного обнаружения подозреваемого на небольших образцах тканей пациента.
FISH также можно использовать для сравнения геномов двух биологических видов, чтобы установить эволюционные взаимосвязи. Подобный метод гибридизации называется зоопарк. Бактериальные FISH-зонды часто являются праймерами для области 16s рРНК.
FISH широко используется в области микробной экологии для идентификации микроорганизмов. Биопленки, например, состоят из сложных (часто) многовидовых бактериальных организаций. Подготовка ДНК-зондов для одного вида и выполнение FISH с помощью этого зонда позволяет визуализировать распределение этого конкретного вида в биопленке. Подготовка зондов (двух разных цветов) для двух видов позволяет исследователям визуализировать / изучать совместную локализацию этих двух видов в биопленке и может быть полезна для определения тонкой архитектуры биопленки.
Сравнительная геномная гибридизация может быть описана как метод, который использует FISH параллельно со сравнением силы гибридизации, чтобы вспомнить любые серьезные нарушения в процессе дупликации ДНК. последовательности в геноме ядра.
Виртуальное кариотипирование - еще одна экономичная, клинически доступная альтернатива панелям FISH, использующим тысячи и миллионы зондов на одном массиве для определения количества копий изменения в масштабах всего генома с беспрецедентным разрешением. В настоящее время этот тип анализа позволяет выявлять только прирост и потерю хромосомного материала и не обнаруживает сбалансированные перестройки, такие как транслокации и инверсии, которые являются отличительными отклонениями, наблюдаемыми при многих типах лейкемии и лимфомы.
Спектральное кариотипирование - это изображение цветных хромосом. Спектральное кариотипирование включает в себя FISH с использованием нескольких форм многих типов зондов, в результате чего каждая хромосома маркируется через ее метафазную стадию. Этот тип кариотипирования используется специально при поиске расположения хромосом.
Еще одна схема процесса FISH.
Микрожидкостный чип, который снизил стоимость теста FISH на 90%.
Изображение FISH с двойной меткой; Бифидобактерии Cy3, Всего бактерий FITC.
Параспеклы, визуализированные с помощью одномолекулярного FISH против NEAT1 (Quasar 570) в клетках U-2 OS (DAPI).
 | На Викискладе есть материалы, связанные с флуоресцентной гибридизацией in situ. |
