Флуоресцентный микроскоп

редактировать

Вертикальный флуоресцентный микроскоп (Olympus BX61) с турелью в виде куба флуоресцентного фильтра над линзами объектива, соединенный с цифровой камерой. Файл: флуоресцентные и конфокальные microscopes.ogv Play media Принцип работы флуоресцентного и конфокального микроскопов

A флуоресцентный микроскоп - это оптический микроскоп, в котором используется флуоресценция вместо или в дополнение к рассеяние, отражение и затухание или поглощение для изучения свойств органических или неорганических веществ. «Флуоресцентный микроскоп» относится к любому микроскопу, который использует флуоресценцию для создания изображения, будь то более простая установка, такая как эпифлуоресцентный микроскоп, или более сложная конструкция, такая как конфокальный микроскоп, в котором используется оптическое сечение для получения лучшего разрешения флуоресцентного изображения.

Содержание

  • 1 Принцип
    • 1.1 Эпифлуоресцентная микроскопия
  • 2 Источники света
  • 3 Подготовка образца
    • 3.1 Биологические флуоресцентные пятна
    • 3.2 Иммунофлуоресценция
    • 3.3 Флуоресцентные белки
  • 4 Ограничения
  • 5 Методы субдифракции
  • 6 Галерея флуоресцентных микрофотографий
  • 7 См. Также
  • 8 Ссылки
  • 9 Внешние ссылки

Принцип

Образец освещается светом с определенной длиной волны (или длинами волн), который поглощается флуорофорами, заставляя их излучать свет с большей длиной волны (т. Е. другого цвета, чем поглощенный свет). Освещающий свет отделяется от гораздо более слабой излучаемой флуоресценции с помощью спектрального эмиссионного фильтра. Типичными компонентами флуоресцентного микроскопа являются источник света (обычно используются ксеноновая дуговая лампа или ртутная лампа ; более совершенными формами являются мощные светодиоды и лазеры ), фильтр возбуждения, дихроичное зеркало (или дихроичный светоделитель ) и (см. Рисунок ниже). Фильтры и дихроичный светоделитель выбираются в соответствии со спектральными характеристиками возбуждения и излучения флуорофора, используемого для маркировки образца. Таким образом, одновременно отображается распределение одного флуорофора (цвета). Многоцветные изображения нескольких типов флуорофоров должны быть составлены путем объединения нескольких одноцветных изображений.

Большинство используемых флуоресцентных микроскопов представляют собой эпифлуоресцентные микроскопы, в которых возбуждение флуорофора и обнаружение флуоресценции выполняются одним и тем же световой путь (то есть через объектив). Эти микроскопы широко используются в биологии и являются основой для более совершенных конструкций микроскопов, таких как конфокальный микроскоп и флуоресцентный микроскоп полного внутреннего отражения (TIRF).

Эпифлуоресцентная микроскопия

Схема флуоресцентного микроскопа.

Большинство флуоресцентных микроскопов, особенно те, которые используются в науках о жизни, имеют эпифлуоресцентную конструкцию, показанную на диаграмме. Свет с длиной волны возбуждения освещает образец через линзу объектива . Флуоресценция , испускаемая образцом, фокусируется на детекторе тем же объективом, который используется для возбуждения, для которого для большего разрешения потребуется линза объектива с более высокой числовой апертурой . Поскольку большая часть возбуждающего света проходит через образец, только отраженный возбуждающий свет достигает объектива вместе с испускаемым светом, и поэтому метод эпифлуоресценции дает высокое отношение сигнал / шум. Дихроичный светоделитель действует как фильтр, зависящий от длины волны, пропускающий флуоресцентный свет через окуляр или детектор, но отражающий оставшийся возбуждающий свет обратно к источнику.

Источники света

Для флуоресцентной микроскопии требуется интенсивное, почти монохроматическое освещение, которое не могут обеспечить некоторые широко распространенные источники света, такие как галогенные лампы. Используются четыре основных типа источников света, включая ксеноновые дуговые лампы или ртутные лампы с фильтром возбуждения, лазеры, источники суперконтинуума и мощные светодиоды. Лазеры наиболее широко используются для более сложных методов флуоресцентной микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения, в то время как ксеноновые лампы, ртутные лампы и светодиоды с дихроичностью возбуждающий фильтр обычно используется в широкопольных эпифлуоресцентных микроскопах. Путем размещения двух матриц микролинз на пути освещения широкопольного эпифлуоресцентного микроскопа можно достичь очень однородного освещения с коэффициентом изменения 1-2%.

Подготовка образца

Файл: 3D-анимация диатомовой водоросли Corethron sp.ogv Воспроизвести медиа 3D-анимация диатомовой водоросли Corethron sp. . Отображает наложения из четырех флуоресцентных каналов (a) Зеленый: [DiOC6 (3) флуоресценция] - окрашивает клеточные мембраны, указывая на основные тела клеток. (b) Голубой: [флуоресценция PLL-A546] - универсальный контрастный краситель для визуализации поверхностей эукариотических клеток. (c) Синий: [флуоресценция Hoechst] - окрашивает ДНК, идентифицирует ядра. (d) Красный: [автофлуоресценция хлорофилла] - разрешение хлоропластов. Анимация начинается с наложения всех доступных флуоресцентных каналов, а затем уточняется визуализация, включая и выключая каналы Образец сельди сперма, окрашенная SYBR green в кювете, освещенная синим светом в эпифлуоресцентном микроскопе. Зеленый SYBR в образце связывается со спермой сельди ДНК и после связывания флуоресцирует, испуская зеленый свет при освещении синим светом.

Чтобы образец был пригоден для флуоресцентной микроскопии, он должен быть флуоресцентным. Есть несколько методов создания флуоресцентного образца; основные методы - это мечение флуоресцентными красителями или, в случае биологических образцов, экспрессия флуоресцентного белка. В качестве альтернативы может использоваться собственная флуоресценция образца (то есть автофлуоресценция ). В биологических науках флуоресцентная микроскопия является мощным инструментом, позволяющим специфическое и чувствительное окрашивание образца для обнаружения распределения белков или других представляющих интерес молекул. В результате существует широкий спектр методов флуоресцентного окрашивания биологических образцов.

Биологические флуоресцентные красители

Многие флуоресцентные красители были разработаны для ряда биологических молекул. Некоторые из них представляют собой небольшие молекулы, которые по своей природе флуоресцентны и связывают интересующую биологическую молекулу. Основными примерами таких красителей являются нуклеиновые кислоты, такие как DAPI и Hoechst (возбуждаемые УФ-светом с длиной волны) и DRAQ5 и DRAQ7 (оптимально возбуждаемые красным светом), которые все связывают малую бороздку ДНК, маркируя, таким образом, ядра клеток. Другие представляют собой лекарства, токсины или пептиды, которые связывают определенные клеточные структуры и были модифицированы с помощью флуоресцентного репортера. Основным примером этого класса флуоресцентных красителей является фаллоидин, который используется для окрашивания волокон актина в клетках млекопитающих. Новый пептид, известный как гибридизирующий пептид коллагена, также можно конъюгировать с флуорофорами и использовать для окрашивания денатурированных коллагеновых волокон. Окрашивание клеточных стенок растений проводят с использованием красителей или красителей, связывающих целлюлозу или пектин. Поиски флуоресцентных зондов с высокой специфичностью, которые также позволяют получать изображения растительных клеток в реальном времени, продолжаются.

Существует множество флуоресцентных молекул, называемых флуорофорами или флуорохромами, например флуоресцеин, Alexa Fluors или DyLight 488, которые могут быть химически связаны с другой молекулой, которая связывает интересующую мишень в образце.

Иммунофлуоресценция

Иммунофлуоресценция - это метод, который использует высокоспецифичное связывание антитела с его антигеном для мечения специфических белков или других молекул. внутри клетки. Образец обрабатывают первичным антителом, специфичным для интересующей молекулы. Флуорофор можно напрямую конъюгировать с первичным антителом. В качестве альтернативы можно использовать вторичное антитело, конъюгированное с флуорофором, которое специфически связывается с первым антителом. Например, первичное антитело, вырабатываемое у мыши, которое распознает тубулин в сочетании с вторичным антимышиным антителом, дериватизированным с флуорофором, можно использовать для мечения микротрубочек в клетке.

Флуоресцентные белки

Современное понимание генетики и доступные методы модификации ДНК позволяют ученым генетически модифицировать белки, чтобы они также несли флуоресцентный белок-репортер. В биологических образцах это позволяет ученому непосредственно сделать интересующий белок флуоресцентным. Затем можно напрямую отслеживать местоположение белка, в том числе в живых клетках.

Ограничения

Флуорофоры теряют способность к флуоресценции, когда они освещаются в процессе, называемом фотообесцвечиванием. Фотообесцвечивание происходит, когда флуоресцентные молекулы накапливают химические повреждения от электронов, возбужденных во время флуоресценции. Фотообесцвечивание может сильно ограничить время, в течение которого образец можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Существует несколько методов уменьшения фотообесцвечивания, таких как использование более устойчивых флуорофоров, минимизация освещения или использование фотозащитных поглотителей химикатов.

Флуоресцентная микроскопия с использованием флуоресцентных репортерных белков позволяет анализировать живые клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, однако клетки чувствительны к фототоксичности, особенно при использовании коротковолнового света. Кроме того, флуоресцентные молекулы имеют тенденцию генерировать реактивные химические соединения при освещении, которое усиливает фототоксический эффект.

В отличие от методов микроскопии в проходящем и отраженном свете флуоресцентная микроскопия позволяет наблюдать только определенные структуры, которые помечены как флуоресцентные. Например, наблюдение за образцом ткани, приготовленным с флуоресцентным окрашиванием ДНК, с помощью флуоресцентной микроскопии показывает только организацию ДНК внутри клеток и ничего не говорит о морфологии клеток.

Методы субдифракции

Волновая природа света ограничивает размер пятна, в которое может быть сфокусирован свет из-за предела дифракции. Это ограничение было описано в XIX веке Эрнстом Аббе и «ограничивает разрешение оптического микроскопа примерно половиной длины волны используемого света». Флуоресцентная микроскопия занимает центральное место во многих методах, которые стремятся преодолеть этот предел с помощью специализированных оптических конфигураций.

В 20 веке были изобретены несколько усовершенствований в методах микроскопии, которые в некоторой степени привели к увеличению разрешения и контрастности. Однако они не преодолели дифракционный предел. В 1978 году были разработаны первые теоретические идеи по преодолению этого барьера путем использования 4Pi микроскопа в качестве конфокального лазерного сканирующего флуоресцентного микроскопа, в котором свет фокусируется идеально со всех сторон в общий фокус, который используется для сканирования объекта «точка за точкой». точечное возбуждение в сочетании с обнаружением «точка за точкой». Однако первая экспериментальная демонстрация микроскопа 4pi состоялась в 1994 году. 4Pi-микроскопия максимизирует количество доступных направлений фокусировки за счет использования двух противоположных линз или микроскопии с двухфотонным возбуждением с использованием красного смещения световое и многофотонное возбуждение.

Интегрированная корреляционная микроскопия объединяет флуоресцентный микроскоп с электронным микроскопом. Это позволяет визуализировать ультраструктуру и контекстную информацию с помощью электронного микроскопа, используя данные флуоресцентного микроскопа в качестве инструмента для маркировки.

Первым методом, который действительно достиг субдифракционного разрешения, был микроскопия STED, предложенный в 1994 году. Этот метод и все методы, следующие за концепцией RESOLFT, основаны на сильном нелинейном взаимодействии между светом и флуоресцентными молекулами. Молекулы сильно движутся между различимыми молекулярными состояниями в каждом конкретном месте, так что, наконец, свет может испускаться только в небольшой части пространства, следовательно, повышенное разрешение.

Также в 1990-х годах был разработан другой метод микроскопии сверхвысокого разрешения, основанный на широкоугольной микроскопии. Существенно улучшенное разрешение по размеру клеточных наноструктур, окрашенных флуоресцентным маркером, было достигнуто за счет развития микроскопии локализации SPDM и структурированного лазерного освещения (пространственно-модулированное освещение, SMI). Сочетание принципа SPDM с SMI привело к созданию микроскопа Vertico SMI. Обнаружение одной молекулы нормальных мигающих флуоресцентных красителей, таких как зеленый флуоресцентный белок (GFP), может быть достигнуто путем дальнейшего развития SPDM, так называемой технологии SPDMphymod, которая позволяет обнаруживать и подсчитывать два разных типа флуоресцентных молекул на молекулярном уровне (эта технология называется двухцветной локализационной микроскопией или 2CLM).

В качестве альтернативы, появление фотоактивированной локализационной микроскопии может дать аналогичные результаты полагаясь на мигание или переключение одиночных молекул, где доля флуоресцирующих молекул в каждый момент времени очень мала. Этот стохастический отклик молекул на приложенный свет также соответствует сильно нелинейному взаимодействию, ведущему к субдифракционному разрешению.

Галерея флуоресцентных микрофотографий

См. Также

Литература

Внешние ссылки

Викискладе есть материалы, связанные с флуоресцентной микроскопией.
Последняя правка сделана 2021-05-20 09:32:57
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте