Войти
Perlecan (PLC), также известный как специфичный для базальной мембраны протеогликан гепарансульфата коровый белок (HSPG) или гепарансульфат протеогликан 2 (HSPG2 ), представляет собой белок, который у человека кодируется HSPG2 ген.
Perlecan представляет собой большой мультидоменный (пять доменов, обозначенных IV) протеогликан, который связывается и перекрестно связывает многие компоненты внеклеточного матрикса (ECM) и поверхность клетки молекулы. Перлекан синтезируется как эндотелиальными, так и гладкомышечными клетками сосудов и откладывается во внеклеточном матриксе. Перлекан высоко консервативен у разных видов, и имеющиеся данные показывают, что он произошел от древних предков путем дупликации генов и перетасовки экзона.
Перлекан состоит из корового белка с молекулярной массой 470 кДа, к которому три длинные цепи (каждая примерно 70-100 кДа) гликозаминогликаны (часто гепарансульфат, HS, но может быть хондроитинсульфат, CS) прилагаются. Основной белок состоит из пяти различных структурных доменов. N-концевой домен I (aa ~ 1-195) содержит сайты присоединения для цепей HS. Хотя цепи HS не требуются для правильной укладки и секреции белка, отсутствие HS или пониженное сульфатирование может снизить способность перлекана взаимодействовать с матричными белками. Удаление цепей HS может повлиять на организацию матрикса и барьерную функцию эндотелия. Домен II содержит четыре повтора, гомологичных лиганд-связывающей части рецептора LDL, с шестью консервативными остатками цистеина и пентапептидом, DGSDE, который опосредует связывание лиганда рецептором LDL. Домен III гомологичен доменам IVa и IVb ламинина. Домен IV состоит из серии модулей IG. С-концевой домен V, который гомологичен домену G длинного плеча ламинина, отвечает за самосборку и может быть важным для образования базальной мембраны in vivo. Таким образом, сердцевинный белок перлекана и цепи HS могут модулировать сборку матрикса, пролиферацию клеток, связывание липопротеинов и клеточную адгезию.
. Доступна диаграмма, показывающая доменную структуру перлекана здесь
Перлекан является ключевым компонентом внеклеточного матрикса сосудов, где он взаимодействует с множеством других компонентов матрикса и помогает поддерживать функцию эндотелиального барьера. Перлекан является мощным ингибитором пролиферации гладкомышечных клеток и, таким образом, считается, что он помогает поддерживать гомеостаз сосудов. Перлекан также может стимулировать активность фактора роста (например, FGF2 ) и, таким образом, стимулировать рост и регенерацию эндотелия.
Модификации гепарансульфатных цепей на C- и N-концевых доменах являются наиболее изученными различиями в секреторном пути перлекана. Хондроитинсульфат может быть заменен гепарансульфатом, и включение сульфата или сахарный состав цепей может измениться. Потеря ферментов, участвующих в синтезе гепарансульфата, приводит к ряду состояний.
Дифференциальная модификация гепарансульфатной цепи может происходить посредством ряда регуляторных сигналов. Перлекан в пластинке роста длинных костей мыши показывает изменения гликозилирования при продвижении хондроцитов из зоны покоя в зону пролиферации. Хотя первоначально считалось, что гликозаминогликановые (ГАГ) цепи перлекана представляют собой исключительно гепарансульфат, цепи хондроитинсульфата могут быть замещены во время определенных регуляторных сигналов. Путем экспрессии рекомбинантной формы N-концевого домена I белка и демонстрации того, что переваривание пептида либо гепараназой, либо хондроитиназой не привело к полной потере активности пептида, было показано, что цепи хондроитинсульфата могут быть добавлены к человеческому организму. перлекан. Это согласуется с предыдущими данными, показывающими, что цепи GAG хондроитинсульфата присоединены к бычьему перлекану, продуцируемому хондроцитами, и что рекомбинантный белок домена I человека гликозилировался как цепями гепарана, так и цепями хондроитинсульфата при экспрессии в клетках яичника китайского хомячка. Предпочтительное добавление цепей гепарансульфата или хондроитинсульфата к доменам I и V могло бы повлиять на дифференцировку мезенхимальных тканей в хрящ, кость или любое количество тканей, но регуляторный механизм перехода от гепарансульфата к добавлению хондроитинсульфата недостаточно изучены.
При изучении влияния протеогликановой композиции на нефритную селективность проницаемости было отмечено, что обработка пуромицином эндотелиальных клеток человека клубочков (HGEC) изменила уровень сульфатирования цепей GAG на протеогликанах, таких как перлекан, что, в свою очередь, вызывает снижение стабильности цепей GAG. Уровни мРНК корового белка протеогликанов не были затронуты, таким образом, уменьшение цепей GAG было результатом действия другого фактора, который в данном случае оказался снижением экспрессии ферментов сульфаттрансферазы, которые играют ключевую роль в биосинтезе ГАГ. Похоже, что может быть некоторое совпадение заболеваний, возникающих из-за потери экспрессии гепарансульфат-протеогликана и потери ферментов, участвующих в биосинтезе гепарансульфата.
Клетки могут изменять свой внеклеточный матрикс и базальные мембраны в ответ на сигналы или стресс. Специфические протеазы действуют на белок во внеклеточной среде, когда у клеток есть причина перемещаться или изменять свое окружение. Катепсин S представляет собой цистеиновую протеазу, которая умеренно ослабляет связывание FGF-положительных клеток с перлекан-положительным субстратом. Катепсин S представляет собой потенциальную протеазу, которая действует на основной белок перлекана в базальной мембране или строме.
Гепарансульфатные цепи перлекана связывают факторы роста в ЕСМ и служат в качестве со-лигандов или усилителей лигандов, когда связаны с рецепторами. Другое исследование показало, что высвобождение связанного с HS основного FGF в культуре может быть достигнуто путем обработки стромелизином, гепаритиназой I, крысиной коллагеназой и плазмином, и эти сайты протеолиза показаны на рисунке 1. Это было предложено в качестве неисчерпывающего списка протеазы, которые могут опосредовать высвобождение факторов роста из гепарансульфатных цепей перлекана. Хотя Whitelock et al. предположили, что консенсусные последовательности расщепления тромбином существуют в коровом белке перлекана, они также постулируют, что любая активация перлекана тромбином на самом деле происходит в результате расщепления других составляющих ЕСМ. В этой статье говорится, что гепараназа ответственна за расщепление гепарансульфатных цепей перлекана в матриксе. Это высвобождает факторы роста, связанные с гепарансульфатом, в частности FGF-10. Добавление гепараназы к культуре клеток эпителия в базальной мембране вызывало увеличение пролиферации эпителиальных клеток из-за высвобождения FGF-10.
В модели роста эксплантата in vitro с использованием эпителия роговицы экспрессия матричной металлопротеиназы (MMP) 2 коррелирует с начальной деградацией исходной базальной мембраны. Реформация базальной мембраны в культуре зависела от начальной активации, за которой следовало подавление MMP-9, в отличие от постоянной экспрессии MMP-2. Это не является доказательством того, что ММР-2 и ММР-9 непосредственно расщепляют белок перлекан in vivo, но показывает, что белки явно модулируют некоторый фактор созревания базальной мембраны. Другое семейство металлопротеаз, семейство Bone Morphogenetic Protein 1 / Tolloid-like, высвобождает c-концевой эндорепеллиновый домен корового белка перлекана. Ламинин-подобный глобулярный домен содержит активный мотив эндорепеллина и не может быть расщеплен клетками, экспрессирующими мутантные и неактивные формы белков BMP-1. Кроме того, критический остаток, необходимый для этого расщепления, был локализован в Asp4197. Этот протеолитический процесс может иметь значение при заболевании, поскольку соответствующий фрагмент был обнаружен в моче пациентов с терминальной почечной недостаточностью и в околоплодных водах беременных женщин, у которых произошел преждевременный разрыв мембраны.
Время экспрессии гена во время развития варьируется от ткани к ткани. Базальные мембраны часто являются движущей силой отделения эпителия от стромы и соединительной ткани. Перлекан имеет особое значение для развития сердечно-сосудистой системы, нервной системы и хрящей.
Развитие бластоцисты до имплантации - это управляемый каскад регуляции генов и межклеточной передачи сигналов. Внеклеточный перлекан наблюдался на стадии бластоцисты эмбрионального развития мыши, специфически активируемый в момент, когда эмбрион достигает «компетентности прикрепления». Это открытие подтвердилось как на уровне мРНК, так и на уровне белка, что было показано с помощью ОТ-ПЦР и иммуноокрашивания. Позднее эмбриональное развитие регулируется так же точно, как и доимплантационное развитие, и является более сложным из-за дифференцировки всех тканей. Первое исследование экспрессии перлекана во время эмбрионального развития показало, что белок сначала экспрессируется во время развития сердечно-сосудистой системы, а затем коррелирует с созреванием большинства тканей в организме, то есть отделением эпителиальных слоев от эндотелия и стромы базальными мембранами. Опять же, это усиление во время сердечно-сосудистого развития сопровождается ролью С-конца перлекана как эндорепеллина.
Пространственно-временная специфичность трансактивации гена перлекана во время развития является ключом к созреванию базальных мембран и, таким образом, к полному отделению эпителия от эндотелия и стромы. Тщательное изучение экспрессии перлекана во время развития куриного эмбриона показало, что перлекан присутствует на стадии морулы и для остального развития, хотя экспрессия может быть временной и точно рассчитанной по времени в определенных тканевых предшественниках. У эмбриона крысы экспрессия перлекана, как было показано, увеличивается в гладкомышечных клетках сосудов (VSMC) после е19 в процессе внутриутробного развития. Это прекрасно коррелирует с прекращением пролиферации VSMC на е18 и изменением их фенотипа. Теория, выдвинутая в этом исследовании, заключается в том, что перлекан играет антипролиферативную роль для VSMC, когда достигается определенная точка развития, во многом подобно зависимой от слияния экспрессии перлекана в культуре. Эти результаты были подтверждены аналогичными результатами исследований легочной артерии и эпителия легких крыс. Было также обнаружено, что в этих тканях начинается продуцирование перлекана после прекращения деления клеток, примерно на 19-й день плода.
Развитие нервной системы и распространение аксонов точно управляется сигналами молекул внеклеточного матрикса. Рост обонятельных нейритов в развитии мышей управляется, по крайней мере частично, ECM, заложенным обонятельными эпителиальными клетками (OECs). Перлекан и ламинин-1, по-видимому, играют важную роль в этом пути наведения, хотя индукция перлекана происходит немного позже, чем ламинин-1. Эти данные подтверждаются более ранними данными, показывающими, что OECs экспрессируют FGF-1 во время обонятельного развития, и что перлекан может стимулировать рост обонятельных сенсорных нейритов в культуре в присутствии FGF-1. Перлекан также продемонстрировал адгезивные свойства нервов в предыдущем исследовании, что также предполагает, что он может играть привлекательную роль в комбинации с ламинином, а не отталкивающую.
Доказано, что развитие хрящей и костей зависит от экспрессии перлекана. Белок становится видимым при иммуноокрашивании на 15-й день во время развития мыши, независимо от других белков базальной мембраны, что позволяет предположить, что он просто является частью ECM развивающихся хондроцитов в дополнение к коллагену II и другим маркерам хряща, которые экспрессируются, начиная с 12-го дня Принимая во внимание данные о том, что мыши, лишенные гена pln, не могут поддерживать стабильный хрящ, очевидно, что перлекан необходим для созревания и стабильности хрящевой структуры. Это подтверждается исследованием, показывающим, что подавление продукции перлекана ингибирует заключительные стадии хондрогенной дифференцировки в фибробластах C3H10T1 / 2 в культуре. Развитие костей, то есть минерализация хрящевой ткани, коррелирует с потерей перлекана и гепарансульфата в хондро-костном соединении (ХПК). Чтобы понять, как гепарансульфат и перлекан направляют мезенхимальные стволовые клетки в остеогенный путь, мезенхимальные стволовые клетки человека обрабатывали гепараназой и хондроитиназой в культуре. Это привело к повышенной минерализации и экспрессии маркеров остеоцитов, что подтверждает данные, показывающие, что потеря гепарансульфата в COJ является ключевым фактором в остеогенезе. Считается, что движущей силой активации остеогенеза гепараназой и хондроитиназой является высвобождение костного морфогенетического белка, связанного в цепях гепарансульфата.
Нокдаун перлекана у эмбриональных рыбок данио был достигнут за счет использования морфолино, нацеленных на транскрипт перлекана. Морфолино были использованы для блокирования трансляции мРНК перлекана у эмбрионов рыбок данио в рамках исследования функции перлекана в развитии скелета и сосудов. Morpholino нацелен на пять первичных нетранслируемых областей мРНК перлекана, таким образом блокируя трансляцию сообщения. Потеря белка перлекана у этих рыб привела к серьезным миопатиям и проблемам с кровообращением. Как показано в более позднем исследовании, проведенном в той же лаборатории, этот фенотип может быть спасен путем добавления экзогенного VEGF-A.
Важность перлекана для развития млекопитающих продемонстрирована экспериментами с нокаутом гена перлекана. Почти половина всех мышей, у которых ген перлекана был нокаутирован (мыши с нулевым перлеканом), умирают в эмбриональный день 10,5, когда ген перлекана обычно начинает экспрессироваться. Другие умирают сразу после рождения с серьезными дефектами, такими как аномальное формирование базальной мембраны, дефектное головное и развитие длинных костей и ахондроплазия. Стратегия нокаута, использованная для первой мыши с нокаутом перлекана, заключалась в флоксировании экзона 6 путем вставки неомициновой кассеты и последующей экспрессии CRE для удаления экзона 6 из генома. Это привело к ранее обсуждавшемуся фенотипу с нарушением хряща и потере целостности базальной мембраны во множестве тканей. Уровень внутриутробной смертности высок, и выжившие мыши умирают вскоре после рождения. Разработанная отдельно модель мыши с нокаутом перлекана была создана путем вставки кассеты неомицина в экзон 7 гена pln. Эти мыши с нокаутом также имели 40% эмбриональной летальности, а остальные мыши умерли вскоре после рождения из-за серьезных аномалий скелета. В еще одной модели нокаута на мышах ген перлекана был мутирован путем гомологичной рекомбинации эндогенного гена перлекана с конструкцией, содержащей 2 и 5 т.п.н. плеч гомологии, окружающих удаленный экзон 3, длина которого составляет всего 45 пар оснований. Эта делеция устраняет прикрепление гепарансульфатной цепи к полученному коровому белку in vivo. Последующее исследование показало, что у мышей, у которых не было добавок гепарансульфата к перлекану, наблюдалось нарушение целостности капсулы хрусталика к 3-ей постнатальной неделе, что указывает на роль гепарансульфата в поддержании целостности базальной мембраны капсулы хрусталика, аналогично модели мышей с нокаутом TGF-β. Мыши с нокаутом экзона 3 также показали снижение способности заживления ран и ангиогенеза при заражении либо повреждением эпидермиса, либо добавлением FGF-2 к роговице. В исследовании повреждения эпидермиса рана, охватывающая глубину эпидермиса, была создана у мышей с отрицательным экзоном 3 и контрольных мышей, а у мышей с нокаутом ангиогенез и признаки заживления ран развивались медленно, возможно, из-за снижения секвестрации фактора роста за счет гепарансульфат-отрицательный перлекан. Аналогичный результат был получен в анализе микрокарманов роговицы, где FGF-2 имплантировали в роговицу мышей и у нормальных мышей индуцировали ангиогенез. У мышей с нокаутом этот ангиогенный эффект был нарушен, хотя и не полностью.
Исследования на мышах с нокаутом гена и заболеваниях человека также выявили критическую роль перлекана in vivo в развитии хряща и активности нервно-мышечных соединений.
Сигнальные пути повышают или понижают уровень транскрипции генов, что, в свою очередь, заставляет клетки изменять профиль экспрессии генов. Конечный эффект сигнальных путей проявляется на промоторе генов, который может включать элементы выше или ниже сайта начала транскрипции, некоторые из которых могут существовать внутри самого транскрибируемого гена. Ряд сигнальных молекул может влиять на изменения в экспрессии перлекана, включая семейства молекул трансформирующего фактора роста-бета (TGF-β), интерлейкина (IL) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF).
Вышестоящие 2,5 тыс. Оснований промоторной области перлекана исследовали с помощью активации CAT в линиях клеток различного гистологического происхождения. Это исследование пришло к выводу, что существует TGF-β-чувствительный элемент в промоторе всего на 285 пар оснований выше сайта начала транскрипции. Этот результат был подтвержден на таких тканях, как клетки карциномы толстой кишки человека. и эпителий матки мышей путем добавления цитокина в среду для культивирования клеток in vitro. Исследования in vitro передачи сигналов TGF-β1 и его влияния на экспрессию перлекана могут иметь различные результаты в разных типах клеток. В клетках гладких мышц коронарных артерий человека в культуре передача сигналов TGF-β1 не оказывала влияния на экспрессию перлекана, хотя она действительно активировала другие компоненты матрикса. In vivo демонстрация динамической регуляции перлекана и его контроля с помощью внеклеточных сигнальных путей имеет решающее значение для нашего понимания роли белка в развитии. С этой целью была создана линия трансгенных мышей, экспрессирующих свиной TGF-β1 под линзоспецифическим промотором αA-кристаллина, а затем была создана другая подобная линия, но с геном, управляемым промотором βb-кристаллина, соответствующим другому линзоспецифическому гену.. Эта динамично развивающаяся ткань обнаруживает серьезную неправильную регуляцию компонентов внеклеточного матрикса, включая перлекан со сверхэкспрессией TGF-β1. Помутнение роговицы произошло у обеих трансгенных линий на ранней стадии развития из-за значительного увеличения экспрессии перлекана, фибронектина и тромбоспондина-1 в мезенхиме роговицы. Эффект был более выражен в линии, управляемой промотором βB-1 Crystallin.
Семейство воспалительных цитокинов IL также активирует транскрипт pln. В модели образования бляшек при болезни Альцгеймера на мышах IL-1-альфа увеличивает экспрессию перлекана в ответ на повреждение мозга. Обработка IL-4 фибробластов десен человека в культуре приводила к увеличению продукции различных гепарансульфатных протеогликанов, включая перлекан. Обработка фибробластов легких человека in vitro IL-1-бета не приводила к какому-либо значительному увеличению продукции перлекана.
Другой сигнальный путь, который, как было показано, усиливает транскрипцию pln, - это путь VEGF. Обработка VEGF165 эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга человека в культуре стимулирует повышенную транскрипцию pln. Эта молекула является лигандом рецептора VEGF-2 (VGFR2), и кажется, что этот ответ VEGF165 специфичен для активации перлекана, что приводит к петле положительной обратной связи с участием фибробластного фактора роста (FGF), рецептора FGF (FGFR) и VEGFR2 в ответ. к повреждению эндотелия. Эта специфическая для микрососудов регуляция VEGF165 повышает вероятность того, что антикоагулянтная функция перлекана является частью процесса контроля повреждений в эндотелии мозга.
Передача сигналов протеинкиназы C предположительно ответственна за активацию транскрипции и трансляции некоторые протеогликаны, включая перлекан. Когда эндоцитозный путь клеток HeLa ингибируется сверхэкспрессией мутантного динамина, активируется протеинкиназа C, и впоследствии увеличивается количество перлекана и белка. Напротив, обычное подавление перлекана в ответ на гипергликемию теряется у мышей, отрицательных по PKC-α.
Передача сигналов интерферона-γ опосредует репрессию транскрипции гена перлекана. Впервые это было показано на клеточных линиях рака толстой кишки, а затем на клеточных линиях другого тканевого происхождения, но в каждом случае для того, чтобы сигнал начал действовать, требовался интактный фактор транскрипции STAT1. Это привело исследователей к мысли, что фактор транскрипции STAT1 взаимодействует с промотором Pln в дистальной области, локализованной в 660 пар оснований выше сайта начала транскрипции. Обработка интерфероном-γ эмбрионов мыши на стадии бластоцисты приводит к потере экспрессии перлекана на трофэктодерме и, следовательно, к морфологии и фенотипу эмбриона в культуре клеток, что наводит на мысль, что эти обработанные интерфероном-γ бластоцисты будут дефектными при имплантации. Предположительно потеря экспрессии перлекана происходит из-за подавления транскрипции посредством активности фактора транскрипции STAT1, как показано ранее. Эти результаты in vitro не обязательно являются репрезентативными для нормальных физиологических концентраций интерферона-γ, и при этом цитокин обычно экспрессируется не широко, а в очень специфические моменты времени развития. Важно отметить, что экспрессия перлекана может быть снижена обработкой экзогенным цитокином, таким как интерферон-γ, и если имело место физиологически ненормальное увеличение экспрессии цитокина, это могло бы помешать имплантации.
Механический и химический стресс может повредить базальные мембраны или клетки, которые они поддерживают. Это может влиять на профиль экспрессии генов в клетках, особенно в их внеклеточном матриксе, который часто обеспечивает физическую поддержку и химический барьер для клеток. Гипоксия, воспаление, механический и химический стресс были изучены на предмет того, как они связаны с экспрессией перлекана.
Гипоксия - это состояние, обнаруживаемое при болезненных состояниях и во время травм, и часто приводит к недостаточной пролиферации эндотелиальных клеток. Это, а также роль перлекана как эндорепеллина побудили провести одно исследование природы регуляции экспрессии перлекана эндотелиальными клетками в условиях гипоксии. В условиях гипоксии это исследование показало, что экспрессия перлекана эндотелиальными клетками микрососудов сердца крысы была снижена на шестьдесят один процент по сравнению с нормальным контролем. Утверждение этой статьи состоит в том, что подавление перлекана ведет к потере активации FAK и, следовательно, к меньшей передаче сигналов ERK, что приводит к снижению пролиферации клеток. Кажется нелогичным, что эндотелиальные клетки будут размножаться медленнее из-за потери перлекана и его субъединицы эндорепеллина. Возможно, эти эндотелиальные клетки просто подавляли транскрипцию многих генов в ответ на условия гипоксии. В другом исследовании гипоксия привела к индукции генов, связанных с апоптозом и гибелью клеток, но репрессия генов не ограничивалась белками, связанными с определенным путем. Когда эпителиальные клетки кишечника Т84 подвергаются воздействию гипоксии в течение 24 часов, происходит значительное увеличение мРНК перлекана и продукции белка. Они связывают это с тем фактом, что многие гены, повышенные в ответ на гипоксию, содержат элемент ответа цАМФ (CRE) в своем промоторе, как и pln. Это различие между эндотелиальными клетками из исследования 2007 г. и эпителиальными клетками, изученными в этих экспериментах, указывает на то, насколько разнообразными могут быть механизмы регуляции перлекана в разных типах клеток.
Развитие бета-амилоидных бляшек в головном мозге связано с началом болезни Альцгеймера. Эти бляшки вызывают постоянное состояние воспаления в областях скопления, что приводит к экспрессии определенных продуктов генов, связанных с воспалением, некоторые из которых поддерживают воспаление в контексте мозга. Как упоминалось ранее, для исследования влияния воспаления головного мозга на уровни экспрессии перлекана в мозге мышей создавали колотые раны, а после воспаления и различных периодов восстановления уровни мРНК и белка оценивали посредством гибридизации in situ и иммуноокрашивания. Уровни перлекана были увеличены в гиппокампе, но не в полосатом теле во время периода заживления, наряду с экспрессией IL 1-альфа. Экспрессия перлекана была прослежена до клеток микроглии в гиппокампе и астроцитах. Эта роль перлекана в образовании бета-амилоидных бляшек подтверждается более ранним исследованием, показавшим, что обработка мозга крыс перлеканом и бета-амилоидом приводила к образованию сенильных бляшек, тогда как лечение одним бета-амилоидом не имело такого же эффекта.
На уровне организма механический стресс оказывает глубокое влияние на целостность внеклеточного матрикса и, вероятно, вызывает индукцию ряда генов ВКМ для репарации и ремоделирования ВКМ в тканевой строме и базальных мембранах. В одном исследовании изучалось влияние давления на глобальную транскрипцию генов in vitro с использованием микроматрицы и системы растяжения клеток, предназначенной для имитации внутриглазного давления в решетчатой пластинке (соединительной ткани) головки зрительного нерва. Их открытие состояло в том, что перлекан и несколько других протеогликанов были активированы в ответ на стимул растяжения. Также индуцировались TGF-β2 и VEGF, возможно, способствуя активации транскрипта и белка перлекана. Было показано, что аутокринная передача сигналов TGF-β является компенсаторным результатом механического стресса in vitro в эндотелиальных клетках. Используя аналогичный механизм растяжения клеток для имитации артериального давления, это исследование показало, что продукция перлекана увеличивается в ответ на механическое напряжение. Это зависит от аутокринной передачи сигналов TGF-β в петле положительной обратной связи с p38 и ERK. Это увеличение выработки эндотелиальными клетками ингибиторов роста VSMC (например, гепарина) обращено вспять в VSMC, где механический стресс вызывает пролиферацию. Деформация клеток VSMC в культуре приводит к активации перлекана со значительным увеличением сульфатирования гепарансульфатных цепей. Это не противоречит показанным данным, в которых экспрессия перлекана постоянна за пределами e19 в VSMC крыс, что позволяет предположить, что перлекан играет антипролиферативную роль в отношении VSMC. В этом случае, похоже, что сигнальная функция молекулы - это активный фактор активации, особенно из-за увеличения сульфатирования гепарансульфатных цепей.
Химическое повреждение органов может повлиять не только на генетическую и механическую целостность клетки, но и на внеклеточный матрикс ткани. Для изучения влияния химического повреждения на клетки печени крыс линии Вистар обрабатывали четыреххлористым углеродом в течение 48 часов перед умерщвлением. До лечения CCl 4 окрашивание перлеканом ограничивалось желчным протоком и синусоидальными кровеносными сосудами печени. После лечения окрашивание перлекана было интенсивным в областях некроза. Это могло быть связано с увеличением капилляризации печени в попытке регенерировать поврежденную ткань. Аналогичный результат был получен при лечении мышей ацетаменофином, когда перлекан и другие компоненты матрикса были сильно экспрессированы в некротических поражениях печени.
Один из убедительных аргументов против Достоверность результатов in vitro культивирования клеток на 2D пластиковых планшетах заключается в том, что окружающая среда не точно отражает среду клеток в организме. Эта проблема решается путем разработки трехмерных клеточных культур с использованием широкого спектра субстратов в качестве каркасов или сред для клеток. В таких условиях экспрессия генов ЕСМ может более точно походить на экспрессию нативного профиля экспрессии. 3D-каркасы, структуры, на которых растут культивируемые клетки, могут состоять из других клеток, то есть сокультуры, синтетических полимеров, имитирующих естественную среду клеток, или очищенного ЕСМ, такого как матригель, и любой смеси этих трех компонентов.
Одна такая система была разработана для изучения развития кожи и образования базальной мембраны между кератиноцитами и стромой. Эта система используется для определения развития базальной мембраны между фибробластами в строме (в данном случае фибробластами в коллагеновом геле I типа) и кератиноцитами, выросшими на поверхности геля. Экспрессия перлекана и, следовательно, созревание базальной мембраны зависит от сшивания нидогеном цепи коллагена IV и γ1 ламинина в этой системе. Этот эффект также привел к отсутствию гемидесмосом в развивающейся ткани. Другая система, использующая гель неорганизованного гидратированного коллагена I, была использована для демонстрации того, что первичные человеческие фибробласты роговицы в конечном итоге проникнут в гель и создадут матрикс, состоящий из коллагена типа I и перлекана, а также нескольких других гликопротеинов сульфатированного матрикса.. Это имитирует программу развития фибробластов роговицы in vivo и реакцию на травму.
Одной из долгосрочных целей создания систем трехмерных культур клеток является создание тканей, которые можно использовать в качестве заменителей для пациентов со многими типами заболеваний.. В тканевых сердечных клапанах, созданных путем посева миофибробластов на коллаген типа I, за которым следуют эндотелиальные клетки, была подтверждена экспрессия гепарансульфат-протеогликана, хотя в этих тканях не было сделано различий между синдеканом и перлеканом. Еще одна процедура, которая может стать возможной с помощью тканевой инженерии, - это кератоэпителиопластика. Пересаженная ткань должна оставаться неповрежденной, для чего требуется предварительно сформированная базальная мембрана. Коллагеновые гели способствовали формированию полной базальной мембраны эпителиальными клетками роговицы в культуре.
Перлекан также обещает служить в качестве основы для посева клеток в культуру. Протоковые и ацинарные клетки слюнной железы человека были успешно выращены на биоактивном пептиде, содержащем последовательность, повторяющуюся в домене IV перлеканового белка. Эти клетки воспроизводят ацинеподобные структуры, подобные тем, что обнаружены в нативных железах и плотных контактах, вместе с полными базальными мембранами в культуре.
В то время как Perlecan подавление вызывает существенное ингибирование роста опухоли и неоваскуляризации у нулевых мышей, напротив, когда перлекан-нулевые клетки вводят голым мышам, наблюдается усиленный рост опухоли по сравнению с контролем. Прогрессирование и патогенез рака тесно связаны с составом внеклеточного матрикса, а роль перлекана и других молекул ЕСМ в развитии рака изучается в большом количестве лабораторий. Поскольку базальная мембрана является первым препятствием на пути экстравазирования клеток карциномы, функции перлекана в этом процессе многочисленны. Одной модельной системой, используемой для изучения экспрессии перлекана в клеточных линиях карциномы, является система клеток метастатической прогрессии меланомы MeWo / 70W. Клетки MeWo обычно менее инвазивны, чем их клональный вариант клеточной линии 70W. Одна лаборатория изучила экспрессию перлекана в 27 инвазивных меланомах, и 26 из 27 образцов показали значительное увеличение сообщения перлекана по сравнению с нормальной тканью тех же пациентов. Затем они использовали клеточные линии MeWo и 70W, чтобы изучить, изменилась ли экспрессия перлекана во время лечения нейротрофинами, которые могут стимулировать инвазию клеток через матригель in vitro. Более инвазивные клетки 70W начали экспрессировать сообщение перлекана через десять минут после стимуляции нейротрофинами, а клетки MeWo не производили никаких сообщений pln независимо от лечения. В этом исследовании особое внимание уделялось тому факту, что активация перлекана произошла еще до активности гепараназы, важного белка, участвующего в процессе экстравазации.
При раке яичников, как и при других формах рака, perl Экспрессия ecan происходит по-разному на протяжении прогрессирования заболевания. Окрашивание перлеканом теряется в базальной мембране яичника, поврежденной инвазивной аденокарциномой, в отличие от окрашивания перлеканом базальных мембран нормальных яичников и яичников с доброкачественными опухолями, где базальная мембрана однородна и очень похожа по составу на таковую в яичниках. другие нормальные ткани. Это согласуется с другими результатами, показывающими потерю перлекана в базальных мембранах, пораженных инвазивным раком шейки матки, распространяющимся на тазовые лимфатические узлы, что неудивительно из-за корреляции повышенных уровней экспрессии мРНК гепараназы с инвазией аналогичной карциномы шейки матки. Напротив, образование опухоли иммортализованной линии эпителиальных клеток мыши RT101, введенной крысам, зависело от экспрессии перлекана клетками мыши, а не от присутствия эндогенного перлекана крысы. Клетки RT101 с перлеканом, нокаутированным антисмысловым действием, не показали образования опухоли в этой системе, однако клетки, экспрессирующие антисмысловой перлекан и рекомбинантную конструкцию, кодирующую домены I, II и III перлекана мыши, действительно показали образование опухоли. Таким образом, в этой системе оказывается, что экспрессия перлекана опухолевыми клетками необходима для агрегации опухоли. Дополнительные исследования модификации цепи GAG или основного белка инвазивными опухолевыми клетками по сравнению с доброкачественными опухолевыми клетками и нормальной тканью были бы информативными для лучшего понимания роли перлеканов в миграции рака.
Несколько лабораторий изучали ангиогенез опухолевых клеток in vitro с использованием антисмысловых конструкций к сообщению перлекана. Полноразмерная кДНК обратного комплемента, управляемая сильным промотором, трансфицируется в различные типы клеток для полного устранения экспрессии перлекана. Антисмысловые клетки карциномы толстой кишки блокируют трансляцию перлекана, что приводит к снижению роста опухоли и ангиогенеза. Аналогичное снижение пролиферации in vitro происходило в клетках NIH 3T3 и клеточной линии меланомы человека, экспрессирующей антисмысловую мРНК перлекана. Результаты in vitro с клеточными линиями саркомы Капоши показали, что потеря перлекана в результате трансфекции антисмысловой конструкцией привела к снижению пролиферации и миграции этого высокометастатического типа клеток. Эти результаты контрастируют с результатами in vivo с теми же линиями саркомы Капоши, которые показывают, что уменьшение количества перлекана приводит к усилению ангиогенеза, что облегчает миграцию и, таким образом, связано с увеличением степени злокачественности опухоли. Антисмысловой нокдаун перлекана в клеточных линиях фибросаркомы приводил к усилению роста и миграции как in vitro, так и in vivo. Эти данные о большем туморогенезе in vivo подтверждаются данными, показывающими, что C-конец белка перлекана действует как эндостатический модуль, теперь известный как эндорепеллин.
Конструкция рибозима была создана для использования в снижении уровней трансляции перлекана.. Этот рибозим был нацелен на домен, кодирующий последовательность I белка перлекана. Он снижает экспрессию перлекана до 80% в клеточной линии рака простаты C42B. В отличие от ранее обсуждавшихся исследований, эти клетки производили меньшие опухоли, чем их родительские клетки, при введении бестимусным мышам. Что такое несоответствие результатов означает для инвазии, неизвестно, хотя верно, что перлекан является частью внеклеточного матрикса в мезенхимальной ткани, и клетки, претерпевающие эпителиально-мезенхимальный переход (EMT), могут активировать экспрессию перлекана как часть их программирование ЕМТ.
Уровни перлекана снижены при многих болезненных состояниях - например, диабет, атеросклероз и артрит. Перлекан играет важную роль в поддержании барьера клубочковой фильтрации. Уменьшение количества перлекана в базальной мембране клубочков играет центральную роль в развитии. Экспрессия перлекана подавляется многими атерогенными стимулами, и поэтому считается, что перлекан играет защитную роль при атеросклерозе. Диабет и атеросклероз - часто ассоциированные синдромы. 80% смертей, связанных с диабетом, связаны с той или иной формой атеросклеротического осложнения, а базальная мембрана эндотелия вовлечена в атерогенный процесс. Было показано, что синтез гепарансульфата снижает в артериях диабетиков и в артериях, в которых развиваются атеросклеротические поражения.
Механизм подавления гепарансульфата в этих поражениях некоторое время оставался неизвестным. Одна теория утверждает, что высокое содержание глюкозы в кровообращении может приводить к уменьшению прикрепления цепи GAG к перлекану, но не обязательно к изменению синтетического пути цепей GAG или основного белка. После обработки эндотелиальных клеток аорты человека средой с высоким содержанием глюкозы секретируемый перлекан содержал меньше включения сульфатов, сопровождаемое меньшим общим включением цепи GAG. Хотя не идентифицирован сигнальный путь, ведущий к этому снижению включения цепи GAG, предполагается, что потеря 30% общего гликозилирования белка может означать потерю одной из трех цепей HS на перлекане в этой модели гипергликемии, связанной с диабетом. Также отмечается, что аналогичное снижение внеклеточного HS без изменения окраски основных белковых цепей происходит в почках диабетиков и в почечных клетках в культуре, обработанной высоким содержанием глюкозы.
Атеросклероз чаще всего является причиной коронарного сердца. болезнь и другие сердечно-сосудистые состояния, а большая агрегация белка перлекана является симптомом прогрессирующих атеросклеротических бляшек. VSMC являются продуцентами перлекана в этом состоянии, а это означает, что большое количество исследований было сосредоточено на понимании способов усиления активности перлекана в этом состоянии. В тесте влияния циркулирующих неэтерифицированных жирных кислот (симптоматического диабета и атерогенеза) на экспрессию перлекана VSMC экспрессия не изменилась по сравнению с контрольными клетками. Это контрастировало с 2-10-кратным увеличением экспрессии других протеогликанов базальной мембраны. Тромбин - еще один маркер, связанный с атерогенезом и прокоагуляцией, и он избирательно увеличивает продукцию перлекана, но не других протеогликанов в VSMC человека в культуре. Предполагается, что этот эффект наблюдается только тогда, когда VSMC достигают слияния, но не до слияния. Эта концепция аналогична ранее упомянутым исследованиям, показывающим, что перлекан продуцируется VSMC только после того, как они прекратили размножение во время разработки. Другой маркер атеросклеротического пути - ангиотензин II, который также усиливает экспрессию перлекана в VSMC в культуре. Учитывая преобладание экспрессии перлекана при атеросклерозе, существует потенциал для терапии, основанной на экспрессии перлекана, и исследования в конечном итоге могут продолжаться в этом направлении.
Мутации в гене HSPG2, который кодирует перлекан, вызывают синдром Шварца-Джампеля.
Перлекан был показан на взаимодействовать с
.. 
