Войти
Клетки эукариотов сортируют неправильно свернутые белки по двум отсекам контроля качества: JUNQ и IPOD, в зависимости от их состояния убиквитинирования. JUNQ и IPOD - это типы цитозольного белка телец включения у эукариот.
нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона связаны и коррелируют с агрегацией белка и накоплением неправильно свернутых белков в телец включения. В течение многих лет агрегация белков считалась случайным процессом, при котором неправильно свернутые белки прилипали друг к другу, образуя включения (представьте себе пучок волос, случайно скопившийся в углу комнаты). Более того, белковые агрегаты считались токсичными агентами и причиной дисфункции и смерти нейронов. Однако недавние исследования с использованием передовых методов (например, флуоресцентной микроскопии ) показывают, что агрегация белков на самом деле может быть строго регулируемым, организованным процессом, с помощью которого клетка защищает себя от токсичных белков путем связывания с тельцами включения. В 2008 году Даниэль Каганович показал, что эукариотические клетки сортируют неправильно свернутые белки в два отдельных тела включения в хорошо управляемом клеточном процессе:
JUNQ и IPOD эволюционно консервативны и обнаруживаются в конкретные и определенные сотовые сайты. Доставка неправильно свернутых агрегированных белков в JUNQ и IPOD требует наличия интактного цитоскелета и определенных компонентов контроля качества клеток, таких как белки теплового шока (HSP). Разделение на два отдельных тельца включения происходит из-за разного обращения и обработки различных видов неправильно свернутых белков (например, убиквитинированных белков по сравнению с неубиквитинированными белками). Разделение агрегатов токсичных белков на тельца включения JUNQ и IPOD - это средство, с помощью которого клетки млекопитающих могут быть омоложены посредством асимметричного деления.
Таким образом, открытие JUNQ и IPOD предоставило новую поразительную перспективу того, как клетки управляют неправильно свернутыми агрегатами. белков и убедительно доказали, что агрегация белков является неслучайным, хорошо регулируемым и контролируемым клеточным процессом. Кроме того, открытие JUNQ и IPOD показало, что в дополнение к временному контролю качества (т.е. зависящему от времени введению поврежденных белков) клетки используют гомеостаз пространственно: если деградация недоступна, защита клеточной среды от неправильно свернутый белок достигается за счет его секвестрации до агрегированного включения.
Для правильного функционирования большинство белков должны сохранять низкоэнергетическую трехмерную структуру, известную как родное состояние. Стабильность белка жестко регулируется на всех этапах его жизни: от колыбели, когда он синтезируется на рибосоме, через фолдинг или сборку, до серьезного - когда белок расщепляется. и очищен от клеточной среды. Белковый гомеостаз (протеостаз) возникает в результате скоординированного действия различных звеньев системы контроля качества клеток: молекулярных шаперонов, протеаз и других регуляторных факторов. Следовательно, жизнеспособность клеток зависит от своевременного и эффективного управления неправильно свернутыми белками. Такое управление с помощью механизма контроля качества включает распознавание неправильно свернутого белка шаперонами и лигазами E3, убиквитинирование и деградация.
коллапс протеостаза., вызванное повреждением, стрессом, мутациями и старением, было вовлечено в качестве основы для большого количества общих заболеваний человека, таких как нейродегенеративные заболевания. Хотя вызывается различными видами мутированных белков (например, при болезни Гентингтона - белок Хантингтин ) и разрушает различные ткани (например, при болезни Гентингтона - стриатум ), такие заболевания имеют общую особенность: накопление неправильно свернутых белков в телец включения. Таким образом, считалось, что тельца включения являются причиной таких заболеваний. Однако природа и характеристики этих внутриклеточных телец включения оставались неуловимыми. Сообщалось, что разные виды белков (например, прионы, ERAD субстраты ) образуют разные виды телец включения (например, агресомы, амилоиды ), но оставалось неясным, объединяются ли эти наблюдения в одно и относятся к одному и тому же субклеточному сайту. Более того, пути, ведущие к образованию включений и вовлечению механизмов контроля качества клеточных белков, не были определены и неизвестны. Таким образом, требовалось систематическое исследование, обеспечивающее всестороннее понимание агрегации белка и телец включения. Открытие JUNQ и IPOD дало возможность по-новому взглянуть на то, как клетка управляет различными типами неправильно свернутых белков, и предложило новую основу для решения большой головоломки агрегации белков.
Клетки эукариотов сортируют неправильно свернутые белки на основе их состояния убиквитинирования., в два отсека контроля качества: 1. JUNQ (зеленый), который привязан к ядру (оранжевый) 2. IPOD (зеленый), который привязан к вакуоли (черный shadow) Судьба неправильно свернутых белков и процесс, приводящий к образованию агрегатных включений, первоначально были изучены с использованием биохимических методов (например, вестерн-блоттинг ).
Более глубокое понимание биологического процесса контроля качества и агрегации белков стало возможным благодаря новому подходу к решению этой проблемы, названному «Визуализация живых клеток».
Визуализация живых клеток позволяет in vivo отслеживание белков в пространстве и времени в их естественной эндогенной среде. Таким образом, такой метод дает больше информации о динамике и стадиях биологических событий и процессов. В этом методе используется преимущество легко обнаруживаемых флуоресцентных белков, слитых с представляющим интерес белком, за которыми затем можно наблюдать внутри клетки с помощью флуоресцентного микроскопа. Затем клетка может быть обработана интересующим изменением (например, лекарством, экспрессией неправильно свернутого белка ), и различные свойства флуоресцентно меченого белка могут быть проанализированы с использованием покадровой микроскопии :
Чтобы отслеживать судьбу цитозольных неправильно свернутых белков in vivo, плазмида, несущая GFP репортер фолдинга, была клонирован. Репортер сворачивания, модельный белок для агрегации, представлял собой Ubc9 (SUMO-конъюгирующий фермент) мутант (UBC9ts), несущий миссенс-мутацию (Y68L ) с термочувствительным (ts) фенотипом. Незначительно стабильный Ubc9ts является полностью функциональным в физиологических разрешающих условиях (25 ° C) благодаря активным клеточным шаперонам. GFP-Ubc9ts трансформировали в дрожжи и визуализировали с помощью флуоресцентного микроскопа.
. Мониторинг датчика сворачивания GFP-Ubc9ts, как полагали, указывает на клеточный протеостаз и для анализа способность системы контроля качества клеточного белка справляться с различными видами стресса. Затем было обнаружено, что в нормальных условиях GFP-Ubc9ts диффундирует в ядре и в цитозоле. Однако после теплового шока GFP-Ubc9ts формировали цитозольные точечные структуры. Поразительно, когда протеасома была нарушена и клиренс неправильно свернутого белка за счет деградации был заблокирован, наблюдали образование двух различных цитозольных включения. Стандартные и консервативные биохимические методы, такие как фракционирование клеток и вестерн-блоттинг, не выявили бы разделения на два типа цитозольных агрегатов.
Было показано, что два обнаруженных включения являются эволюционно консервативными компартментами контроля качества с разными характеристиками и различными функциями. Они были названы JUNQ (отделение контроля ядерного качества JUxta) и IPOD (отложение нерастворимых белков) и представляют два клеточных пути секвестрации и управления склонными к агрегации потенциально токсичными белками.
Разделение субстратов для контроля качества (т. Е. неправильно свернутые белки ) по любому отсеку зависит от их статуса убиквитинирования и состояния агрегации (т.е. растворимости):
Убиквитинированные белки доставляются в JUNQ, где они процессируются для деградации протеасомой. Неправильно свернутые белки, которые не убиквитинированы и не агрегированы на концах, секвестрируются в IPOD.
Таким образом, субклеточное расположение неправильно свернутого белка (то есть в JUNQ или в IPOD) предоставляет информацию о его взаимодействии с механизмом контроля качества клеточного белка (например, его Лигаза E3 ).
JUNQ - это JU xta N подконтрольный отсек Q uality.
Включение JUNQ, наблюдаемое убиквитинированным белком VHL (зеленый), привязано к ядру (оранжевый). Для поддержания клеточного гомеостаза, контроля качества клеток Система должна различать свернутые и неправильно свернутые белки. Неправильно свернутый белок будет распознан и тщательно обработан путем рефолдинга или убиквитинирования и протеасомной деградации.
Однако увеличение количества неправильно свернутого белка в клетках из-за различных видов стрессов (например, тепловой шок ) может привести к насыщению и истощению механизмов контроля качества. В таких случаях деградация неправильно свернутых белков недоступна, и должна выполняться вторая линия механизма активной клеточной защиты: направление неправильно свернутых белков в определенные клеточные сайты.
JUNQ служит таким секвестром. Было показано, что, когда протеасома нарушена (например, из-за низкого уровня экспрессии протеасомы субъединицы RPN11), убиквитинированные неправильно свернутые белки сортируются в JUNQ. После выхода из стрессовых условий (например, восстановления после теплового шока при допустимой температуре) неправильно свернутые белки, которые накапливаются в JUNQ, могут быть повторно свернуты клеточным шапероном механизм, или деградированный 26S протеасомой. Таким образом, секвестрация белка в JUNQ обратима.
JUNQ - это не мембранно-связанный клеточный сайт, расположенный на краю ядра, в непосредственной близости от эндоплазматического ретикулума. Анализы FRAP и FLIP показали, что белки в JUNQ растворимы и обмениваются с цитозолем, что позволяет предположить, что JUNQ имеет динамическую структуру.
Доставка в JUNQ зависит от молекулярных шаперонов и ко-шаперонов и от актина цитоскелета. Неправильно свернутые белки должны быть убиквитинированы, чтобы их можно было отсортировать в JUNQ. Если убиквитинирование заблокировано, неправильно свернутый белок будет направлен на включение IPOD. Неправильно свернутый белок. Накопление рекрутирует 26S протеасомы в JUNQ.
IPOD - это I nsoluble P rotein D эпозитный отсек.
Включение IPOD, видимое неубиквитинированным белком VHL (красный), привязанным к вакуоли (зеленый). Становится все более очевидным, что клеточный способность поддерживать протеостаз снижается с возрастом, вызывая позднее начало нейродегенеративных заболеваний. При таких заболеваниях (например, болезнь Хантингтона ) мутировавший белок неправильно свертывается и становится токсичным для клеточной среды различными способами, такими как денатурация цитозольных белков. Неспособная разлагать эти токсичные виды, клетка должна изолировать их, чтобы избежать их опасного взаимодействия с клеточным протеомом. Было показано, что IPOD является субклеточным сайтом, в который изолированы токсичные амилоидогенные белки, тем самым служа в качестве защитного компартмента контроля качества.
Кроме того, группа Линдквиста предположила, что IPOD - это место, где прионы дрожжей подвергаются процессу созревания. Таким образом, IPOD может служить не только сайтом секвестрации, но также и функциональным компартментом.
IPOD представляет собой не- мембранно связанный клеточный сайт, который у дрожжей располагается у вакуоли. Анализы FRAP и FLIP показали, что белки в IPOD плотно упакованы, не растворимы и не обмениваются с цитозолем. Амилоидогенные белки, такие как белок Хантингтин, являются субстратами IPOD.
Неправильно свернутые белки должны быть не убиквитинированы, чтобы их можно было отсортировать на IPOD. Убиквитинирование субстрата IPOD, такого как грибной прион RNQ1 , приведет к его секвестрации во включении JUNQ.
При накоплении неправильно свернутых белков дезагрегаза шаперон, белок AAA HSP104 локализуется в IPOD. Еще предстоит определить, функционирует ли HSP104 в IPOD или просто изолирован там, будучи прикрепленным к подложке.
Преаутофагосомная структура (PAS) локализуется IPOD. Однако не было показано, что субстраты IPOD доставляются в вакуоль, поэтому связь между IPOD и аутофагией еще предстоит определить.
