Войти
Иммунопреципитация (IP) - это метод осаждения белкового антигена из раствора с использованием антитела, которое специфически связывается с этим конкретным белком. Этот процесс можно использовать для выделения и концентрирования определенного белка из образца, содержащего многие тысячи различных белков. Иммунопреципитация требует, чтобы антитело было связано с твердым субстратом в какой-то момент процедуры.
Включает использование антител, специфичных для известный белок для выделения этого конкретного белка из раствора, содержащего множество различных белков. Эти растворы часто имеют форму неочищенного лизата растительной или животной ткани. Другими типами образцов могут быть биологические жидкости или другие образцы биологического происхождения.
Иммунопреципитация интактных белковых комплексов (т. Е. Антигена вместе с любыми белками или лигандами, которые с ним связаны) известна как совместная -иммунопреципитация (Co-IP). Co-IP работает путем выбора антитела, которое нацелено на известный белок, который, как считается, является членом более крупного комплекса белков. Путем нацеливания на этот известный член антитела может стать возможным вывести весь белковый комплекс из раствора и, таким образом, идентифицировать неизвестных членов комплекса.
Это работает, когда белки, входящие в состав комплекса, плотно связываются друг с другом, что позволяет вытащить несколько членов комплекса из раствора, зацепившись за один член с помощью антитела. Эту концепцию вытягивания белковых комплексов из раствора иногда называют «вытягиванием». Co-IP - это мощный метод, который регулярно используется молекулярными биологами для анализа белок-белковых взаимодействий.
Рабочий процесс ChIP-секвенирования Иммунопреципитация хроматина (ChIP) - это метод, используемый для определения местоположения сайтов связывания ДНК в геноме для конкретного белка интересно. Этот метод дает представление о взаимодействиях белок-ДНК, которые происходят внутри ядра живых клеток или тканей. in vivo природа этого метода отличается от других подходов, традиционно используемых для ответа на те же вопросы.
Принцип, лежащий в основе этого анализа, заключается в том, что ДНК-связывающие белки (включая факторы транскрипции и гистоны ) в живых клетках могут быть поперечно-сшитыми к ДНК, которую они связывают. Используя антитело, специфичное к предполагаемому ДНК-связывающему белку, можно иммунопреципитировать комплекс белок-ДНК из клеточных лизатов. сшивание часто достигается путем нанесения формальдегида на клетки (или ткань), хотя иногда бывает выгодно использовать более определенный и последовательный сшивающий агент, такой как DTBP. После сшивания клетки лизируются, и ДНК разбивается на части длиной 0,2–1,0 т.п.н. с помощью обработки ультразвуком. На этом этапе проводится иммунопреципитация, приводящая к очистке комплексов белок-ДНК. Очищенные комплексы белок-ДНК затем нагревают, чтобы обратить вспять формальдегидное сшивание белков и комплексов ДНК, что позволяет отделить ДНК от белков. Затем идентичность и количество выделенных фрагментов ДНК можно определить с помощью ПЦР. Ограничение проведения ПЦР на выделенных фрагментах состоит в том, что необходимо иметь представление о том, на какую область генома нацелена, чтобы получить правильные праймеры для ПЦР. Иногда это ограничение обходится просто путем клонирования выделенной геномной ДНК в плазмидный вектор и последующего использования праймеров, специфичных для области клонирования этого вектора. В качестве альтернативы, когда кто-то хочет найти, где белок связывается в масштабе всего генома, используется ChIP-Sequencing, которое недавно стало стандартной технологией, которая может локализовать сайты связывания белка с высокой пропускной способностью и стоимостью - эффективный способ, позволяющий также охарактеризовать цистром . Ранее также использовали ДНК-микрочип (ChIP-on-chip или ChIP-chip ).
Подобно иммунопреципитации хроматина (ChIP), описанной выше, но вместо нацеливания на ДНК-связывающие белки, как в ChIP, иммунопреципитация RNP нацелена на рибонуклеопротеины ( РНП). Сначала лизируются живые клетки, а затем целевой белок и связанная с ним РНК иммунопреципитируются с использованием антитела, нацеленного на интересующий белок. Очищенные комплексы РНК-белок можно разделить путем экстракции РНК, а идентичность РНК можно определить с помощью секвенирования кДНК или ОТ-ПЦР. Некоторые варианты RIP, такие как PAR-CLIP, включают стадии перекрестного сшивания, которые затем требуют менее осторожных условий лизиса.
Анализ с использованием меченых белков Одним из основных технических препятствий с иммунопреципитацией является большая сложность создания антитела, которое специфически нацелено на один известный белок. Чтобы обойти это препятствие, многие группы создают теги либо на C-, либо на N-конце интересующего белка. Преимущество здесь в том, что одну и ту же метку можно использовать снова и снова для многих разных белков, и исследователь может каждый раз использовать одно и то же антитело. Преимущества использования меченых белков настолько велики, что этот метод стал обычным для всех типов иммунопреципитации, включая все типы IP, описанные выше. Примерами используемых тегов являются тег зеленый флуоресцентный белок (GFP), тег глутатион-S-трансфераза (GST) и тег FLAG-tag. Хотя использование тега для включения раскрывающихся списков удобно, это вызывает некоторые опасения относительно биологической значимости, поскольку сам тег может либо скрывать нативные взаимодействия, либо вводить новые и неестественные взаимодействия.
Двумя общими методами иммунопреципитации являются метод прямого захвата и метод непрямого захвата.
Антитела, специфичные для определенного белка (или группы белков), иммобилизованы на твердофазном субстрате, таком как суперпарамагнитные микрогранулы или на микроскопических агарозных (немагнитных) шариках. Затем к смеси белков добавляют шарики со связанными антителами, и белки, на которые нацелены антитела, захватываются на шариках через антитела; другими словами, они становятся иммунопреципитированными.
Антитела, специфичные для конкретного белка или группы белков, добавляют непосредственно в смесь белков. Антитела еще не прикреплены к твердофазной подложке. Антитела могут свободно плавать вокруг смеси белков и связывать свои мишени. По прошествии времени шарики, покрытые белком A / G, добавляют к смеси антитела и белка. На этом этапе антитела, которые теперь связаны со своими мишенями, будут прилипать к шарикам.
С этого момента прямой и косвенный протоколы сходятся, потому что образцы теперь имеют одинаковые ингредиенты. Оба метода дают одинаковый конечный результат с белком или белковыми комплексами, связанными с антителами, которые сами иммобилизованы на шариках.
Непрямой подход иногда предпочтителен, когда концентрация белка-мишени низкая или когда специфическое сродство антитела к белку является слабым. Непрямой метод также используется, когда кинетика связывания антитела с белком является медленной по разным причинам. В большинстве случаев прямой метод является предпочтительным и по умолчанию.
Исторически твердофазной подложкой для иммунопреципитации, используемой большинством ученых, была высокопористая агароза бусинки (также известные как агарозные смолы или суспензии). Преимущество этой технологии заключается в очень высокой потенциальной связывающей способности, так как практически вся губчатая структура агарозной частицы (размером от 50 до 150 мкм) доступна для связывания антител (которые, в свою очередь, будут связывать целевые белки) и использования стандартного лабораторного оборудования для всех аспектов протокола IP без необходимости использования специального оборудования. Преимущество чрезвычайно высокой связывающей способности должно быть тщательно сбалансировано с количеством антитела, которое исследователь готов использовать для покрытия гранул агарозы. Поскольку антитела могут быть фактором, ограничивающим затраты, лучше всего рассчитать в обратном порядке от количества белка, которое необходимо захватить (в зависимости от анализа, который будет выполняться ниже по потоку), от до количество антитела, которое требуется для связывания этого количества белка (с небольшим избытком, добавленным для учета неэффективности системы), и обратно до количества агарозы, которое необходимо для связывания это конкретное количество антител. В случаях, когда насыщение антителами не требуется, эта технология не имеет себе равных по способности захватывать чрезвычайно большие количества захваченных белков-мишеней. Предупреждение здесь состоит в том, что «преимущество высокой емкости» может стать «недостатком высокой емкости», которое проявляется, когда огромная связывающая способность сефарозы / агарозы бусинки не полностью пропитаны антителами. Часто бывает, что количество антител, доступное исследователю для эксперимента по иммунопреципитации, меньше, чем достаточно для насыщения гранул агарозы, используемых при иммунопреципитации. В этих случаях исследователь может получить частицы агарозы, которые только частично покрыты антителами, и часть связывающей способности гранул агарозы, которая не покрыта антителами, может свободно связывать все, что будет прилипать, что приводит к повышенному фоновый сигнал из-за неспецифического связывания компонентов лизата с гранулами, что может затруднить интерпретацию данных. Хотя некоторые могут возразить, что по этим причинам разумно сопоставить количество агарозы (с точки зрения связывающей способности) с количеством антитела, которое человек желает связать для иммунопреципитации, простой способ уменьшить проблему неспецифических связывание с гранулами агарозы и повышение специфичности заключается в преклификации лизата, что настоятельно рекомендуется для любой иммунопреципитации.
Лизаты представляют собой сложные смеси белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот, а также должен предполагать, что некоторое количество неспецифического связывания с IP-антителом, белком A / G или подложкой в форме гранул будет происходить и отрицательно влиять на обнаружение иммунопреципитированной мишени (ей). В большинстве случаев предварительная очистка лизата в начале каждого эксперимента по иммунопреципитации (см. Шаг 2 в разделе «Протокол» ниже) является способом удаления потенциально реактивных компонентов из клеточного лизата перед иммунопреципитацией для предотвращения неспецифическое связывание этих компонентов с IP-гранулами или антителом. Основная процедура предварительной очистки описана ниже, при этом лизат инкубируется только с шариками, которые затем удаляются и выбрасываются перед иммунопреципитацией. Однако этот подход не учитывает неспецифическое связывание с IP-антителом, которое может быть значительным. Следовательно, альтернативный метод предварительной очистки заключается в инкубации белковой смеси с точно такими же компонентами, которые будут использоваться при иммунопреципитации, за исключением того, что нецелевое, нерелевантное антитело того же подкласса антител, что и IP-антитело, используется вместо IP-антитела. само антитело. Этот подход пытается использовать как можно более близкие к точным условиям и компонентам IP, как и фактическую иммунопреципитацию, для удаления любых неспецифических клеточных компонентов без захвата целевого белка (если, конечно, целевой белок неспецифически не связывается с каким-либо другим компонентом IP, что следует должным образом контролировать, анализируя отброшенные шарики, используемые для преклификации лизата). Затем целевой белок может быть иммунопреципитирован с уменьшенным риском неспецифического связывания, мешающего интерпретации данных.
В то время как подавляющее большинство иммунопреципитации выполняется с использованием гранул агарозы, использование суперпарамагнитных гранул для иммунопреципитации является гораздо более новым подходом, который только недавно получил широкое распространение. популярность в качестве альтернативы агарозным бусам для IP приложений. В отличие от агарозы, магнитные шарики твердые и могут быть сферическими, в зависимости от типа шарика, а связывание антител ограничено поверхностью каждой шарика. Хотя эти шарики не обладают преимуществом пористого центра для увеличения связывающей способности, магнитные шарики значительно меньше, чем шарики агарозы (от 1 до 4 мкм), и большее количество магнитных шариков на объем, чем шарики агарозы, в совокупности дает магнитным шарикам эффективную эффективность. отношение площади поверхности к объему для оптимального связывания антител.
Имеющиеся в продаже магнитные шарики можно разделить по однородности размера на монодисперсные и полидисперсные шарики. Монодисперсные шарики, также называемые микрогранулами, демонстрируют точную однородность, и поэтому все шарики обладают идентичными физическими характеристиками, включая связывающую способность и уровень притяжения к магнитам. Полидисперсные шарики, хотя и схожи по размеру с монодисперсными шариками, демонстрируют широкий диапазон изменчивости размера (от 1 до 4 мкм), который может влиять на их связывающую способность и магнитный захват. Хотя оба типа гранул коммерчески доступны для применения в иммунопреципитации, более качественные монодисперсные суперпарамагнитные гранулы более идеальны для автоматических протоколов из-за их постоянного размера, формы и характеристик. Монодисперсные и полидисперсные суперпарамагнитные шарики предлагаются многими компаниями, включая Invitrogen, Thermo Scientific и <148.>Millipore.
Сторонники магнитных шариков заявляют, что шарики демонстрируют более высокую скорость связывания белка по сравнению с шариками агарозы для иммунопреципитации, хотя стандартные иммунопреципитации на основе агарозных шариков были выполнены в 1 час. Также были сделаны заявления о том, что магнитные шарики лучше подходят для иммунопреципитации чрезвычайно больших белковых комплексов из-за полного отсутствия верхнего предела размера таких комплексов, хотя объективных свидетельств, подтверждающих это утверждение, нет. Природа технологии магнитных шариков действительно приводит к меньшему количеству операций с образцами из-за снижения физической нагрузки на образцы магнитной сепарации по сравнению с повторным центрифугированием при использовании агарозы, что может в значительной степени способствовать увеличению выхода лабильных (хрупких) белковых комплексов. Однако при выборе поддержки иммунопреципитации следует учитывать дополнительные факторы, такие как связывающая способность, стоимость реагента, потребность в дополнительном оборудовании и возможность автоматизировать процессы IP.
Сторонники как агарозных, так и магнитных шариков могут спорить, благоприятствует ли огромная разница в связывающей способности двух шариков одному конкретному типу шариков. При сравнении гранул с гранулами гранулы агарозы имеют значительно большую площадь поверхности и, следовательно, большую связывающую способность, чем магнитные гранулы, из-за большого размера гранул и губчатой структуры. Но переменный размер пор агарозы вызывает потенциальный верхний предел размера, который может повлиять на связывание чрезвычайно больших белков или белковых комплексов с внутренними сайтами связывания, и поэтому магнитные шарики могут быть лучше подходят для иммунопреципитации больших белков или белковых комплексов, чем шарики агарозы. хотя независимых сравнительных свидетельств, подтверждающих оба этих случая, нет.
Некоторые утверждают, что значительно большая связывающая способность шариков агарозы может быть недостатком из-за большей способности неспецифического связывания. Другие могут выступать за использование магнитных шариков из-за того, что для насыщения общей связывающей способности шариков агарозы требуется большее количество антител, что, очевидно, было бы экономическим недостатком использования агарозы. Хотя эти аргументы верны вне контекста их практического использования, эти аргументы игнорируют два ключевых аспекта принципа иммунопреципитации, который демонстрирует, что решение использовать агарозу или магнитные шарики не определяется просто связывающей способностью.
Во-первых, неспецифическое связывание не ограничивается сайтами связывания антител на иммобилизованной подложке; любая поверхность антитела или компонента реакции иммунопреципитации может связываться с неспецифическими составляющими лизата, и, следовательно, неспецифическое связывание все равно будет происходить даже при использовании полностью насыщенных гранул. Вот почему так важно провести предварительную очистку образца перед проведением иммунопреципитации.
Во-вторых, способность захватывать целевой белок напрямую зависит от количества используемого иммобилизованного антитела, и, следовательно, при параллельном сравнении агарозы и иммунопреципитации на магнитных шариках, большинство белков, которые поддерживают захват ограничен количеством добавленного антитела. Таким образом, решение о насыщении любого типа поддержки зависит от количества необходимого белка, как описано выше в разделе «Агароза» на этой странице.
Стоимость использования любого типа поддержки является ключевым определяющим фактором при использовании агарозы или магнитных шариков для иммунопреципитации. Типичный на первый взгляд расчет стоимости магнитных шариков по сравнению с шариками сефарозы может сделать шарики сефарозы менее дорогими. Но магнитные шарики могут иметь конкурентоспособную цену по сравнению с агарозой для иммунопреципитации в аналитическом масштабе в зависимости от используемого метода IP и объема шариков, необходимого для реакции IP.
При использовании традиционного периодического метода иммунопреципитации, как указано ниже, когда все компоненты добавляются в пробирку во время IP-реакции, физические характеристики обработки агарозных гранул требуют минимального количества гранул для каждого IP-эксперимента (обычно в диапазон от 25 до 50 мкл шариков на IP). Это связано с тем, что шарики сефарозы должны быть сконцентрированы на дне пробирки путем центрифугирования, а супернатант удаляется после каждой инкубации, промывки и т. Д. Это налагает абсолютные физические ограничения на процесс, поскольку осадки шариков агарозы менее 25-50 мкл затруднены, если не невозможно визуально идентифицировать на дне пробирки. При использовании магнитных шариков минимальное количество шариков не требуется из-за магнитной обработки, и поэтому, в зависимости от целевого антигена и IP-антитела, можно использовать значительно меньше магнитных шариков.
И наоборот, спин-колонки можно использовать вместо обычных микроцентрифужных пробирок для значительного уменьшения количества гранул агарозы, необходимых для реакции. Вращающиеся колонки содержат фильтр, который позволяет всем компонентам IP, кроме гранул, проходить через короткое центрифугирование и, следовательно, обеспечивает метод использования значительно меньшего количества гранул агарозы с минимальными потерями.
Как упоминалось выше, для использования гранул агарозы в иммунопреципитации требуется только стандартное лабораторное оборудование, тогда как для IP-реакций на основе магнитных гранул требуются мощные магниты. Хотя оборудование для магнитного захвата может быть дорогостоящим, быстрое завершение иммунопреципитации с использованием магнитных шариков может быть финансово выгодным подходом, когда наступает срок выплаты грантов, поскольку 30-минутный протокол с магнитными шариками по сравнению с ночной инкубацией при 4 ° C с шариками агарозы. может привести к созданию большего количества данных за более короткий промежуток времени.
Дополнительным преимуществом использования магнитных шариков является то, что автоматические устройства иммунопреципитации становятся более доступными. Эти устройства не только сокращают объем работы и время для выполнения IP-адреса, но также могут использоваться для высокопроизводительных приложений.
Хотя явные преимущества использования магнитных шариков включают в себя повышенную скорость реакции, более бережное обращение с образцами и возможность автоматизации, выбор использования агарозы или магнитных шариков на основе связывающей способности поддерживающая среда и стоимость продукта могут зависеть от интересующего белка и используемого метода IP. Как и во всех анализах, требуется эмпирическое тестирование, чтобы определить, какой метод является оптимальным для данного приложения.
После выбора технологии гранул твердого субстрата антитела связываются с гранулами, и гранулы, покрытые антителами, могут быть добавлены к гетерогенному белку. образец (например, гомогенизированная ткань). На этом этапе антитела, иммобилизованные на гранулах, будут связываться с белками, которые они специфически распознают. Как только это произошло, часть протокола иммунопреципитации фактически завершена, поскольку конкретные интересующие белки связываются с антителами, которые сами иммобилизованы на шариках. Отделение иммунокомплексов от лизата является чрезвычайно важной серией этапов, поскольку белок (белки) должны оставаться связанными друг с другом (в случае ко-IP) и связываться с антителом во время этапов отмывки, чтобы удалить несвязанные белки и уменьшают фон.
При работе с гранулами агарозы гранулы должны быть выделены из образца путем кратковременного вращения в центрифуге с усилием от 600 до 3000 x g (умноженное на стандартную гравитационную силу). Этот этап может быть выполнен в стандартной микроцентрифужной пробирке, но для более быстрого разделения, большей консистенции и более высокого извлечения процесс часто выполняется в небольших центрифугах с размером пор, который позволяет жидкости, но не агарозным шарикам, проходить. После центрифугирования гранулы агарозы образуют очень рыхлый пушистый осадок на дне пробирки. Супернатант, содержащий примеси, можно аккуратно удалить, чтобы не повредить шарики. Затем к шарикам может быть добавлен промывочный буфер, и после смешивания шарики снова разделяются центрифугированием.
В случае суперпарамагнитных шариков образец помещают в магнитное поле, чтобы шарики могли собираться на стенках пробирки. Эта процедура обычно длится примерно 30 секунд, и оставшаяся (нежелательная) жидкость удаляется пипеткой. Промывка осуществляется путем ресуспендирования шариков (с магнита) в промывочном растворе и последующего концентрирования шариков обратно на стенке пробирки (помещением пробирки обратно на магнит). Обычно промывку повторяют несколько раз, чтобы обеспечить надлежащее удаление загрязнений. Если суперпарамагнитные шарики однородны по размеру и магнит спроектирован должным образом, шарики будут равномерно концентрироваться на стороне пробирки, и промывочный раствор можно будет легко и полностью удалить.
После промывки осажденный белок (белки) элюируют и анализируют с помощью гель-электрофореза, масс-спектрометрии, вестерн-блоттинга или любого количества других методов идентификации составляющих в комплексе. Время протокола иммунопреципитации сильно различается из-за множества факторов, причем время протокола увеличивается с количеством необходимых промывок или с более медленной кинетикой реакции пористых гранул агарозы.
