Войти
Белки мембраны эритроцитов, разделенные с помощью SDS-PAGE в соответствии с их молекулярными массами SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия ) - это прерывистая электрофоретическая система, разработанная Ульрихом К. Лэммли, которая является обычно используется как метод разделения белков с молекулярными массами от 5 до 250 кДа. Совместное использование додецилсульфата натрия (SDS, также известного как лаурилсульфат натрия) и полиакриламидного геля позволяет устранить влияние структуры и заряда, а белки разделяются исключительно на основе различий в их молекулярной массе.
Разворачивание белка с SDS 
Разворачивание белка при нагревании SDS-PAGE - это метод электрофореза, который позволяет разделить белок по массе. Среда (также называемая «матрицей») представляет собой прерывистый гель на основе полиакриламида. Кроме того, используется SDS (додецилсульфат натрия ). Около 1,4 грамма SDS связываются с граммом белка, что соответствует одной молекуле SDS на две аминокислоты. SDS действует как поверхностно-активное вещество, маскируя собственный заряд белков и придавая им очень похожие отношения заряда к массе. Собственные заряды белков пренебрежимо малы по сравнению с загрузкой SDS, а положительные заряды также значительно уменьшаются в основном диапазоне pH разделяющего геля. При приложении постоянного электрического поля белок перемещается к аноду, каждый с разной скоростью, в зависимости от его массы. Эта простая процедура позволяет точно разделить белок по массе.
SDS имеет тенденцию к образованию сферических мицелл в водных растворах с концентрацией выше определенной, называемой критической мицеллярной концентрацией (CMC). Выше критической мицеллярной концентрации от 7 до 10 миллимолей в растворах SDS одновременно встречается в виде отдельных молекул (мономер ) и в виде мицелл, ниже CMC SDS встречается только в виде мономеров в водных растворах. При критической концентрации мицелл мицелла состоит примерно из 62 молекул SDS. Однако только мономеры SDS связываются с белками посредством гидрофобных взаимодействий, тогда как мицеллы SDS являются анионными снаружи и не адсорбируют какой-либо белок. SDS является амфипатическим по природе, что позволяет ему раскрывать как полярные, так и неполярные участки структуры белка. При концентрациях SDS выше 0,1 миллимоля начинается разворачивание белков, а выше 1 мМ большинство белков денатурируются. Из-за сильного денатурирующего эффекта SDS и последующей диссоциации белковых комплексов четвертичные структуры обычно не могут быть определены с помощью SDS. Исключение составляют белки, стабилизированные ковалентным сшиванием, например. -S-S- связи и SDS-устойчивые белковые комплексы, которые стабильны даже в присутствии SDS (последний, однако, только при комнатной температуре). Для денатурирования устойчивых к SDS комплексов требуется высокая энергия активации, которая достигается нагреванием. Устойчивость к SDS основана на метастабильности белковой складки. Хотя нативный, полностью свернутый, устойчивый к SDS белок не обладает достаточной стабильностью в присутствии SDS, химическое равновесие денатурации при комнатной температуре происходит медленно. Стабильные белковые комплексы характеризуются не только устойчивостью к SDS, но также устойчивостью к протеазам и увеличенным биологическим периодом полужизни.
В качестве альтернативы электрофорез в полиакриламидном геле также можно проводить с катионными поверхностно-активными веществами CTAB на CTAB-PAGE или 16-BAC на BAC-PAGE.
Метод SDS-PAGE состоит из приготовления геля, подготовка образцов, электрофорез, окрашивание белков или вестерн-блоттинг и анализ полученного рисунка полос.
Гребни для образцов с разным количеством карманов, каждый выступ оставляет карман в геле при извлечении 
Полимеризованный разделяющий и укладывающий гель перед удалением гребня для образцов (белый) между разделителями ( черный), в накладывающем геле небольшое количество бромфенолового синего для улучшения видимости, разделяющий гель не окрашивается При использовании различных буферов в геле (прерывистый гель-электрофорез) гели готовят за один день до электрофореза, так что диффузия не приводит к смешиванию буферов. Гель получают путем радикальной полимеризации в форме, состоящей из двух герметичных стеклянных пластин с прокладками между стеклянными пластинами. В типичной настройке мини-геля прокладки имеют толщину 0,75 мм или 1,5 мм, что определяет несущую способность геля. Для заливки гелевого раствора пластины обычно зажимают на подставке, которая временно закрывает открытую нижнюю сторону стеклянных пластин двумя прокладками. Для гелевого раствора акриламид смешивается в качестве гелеобразователя (обычно 4% об. / Об. В геле для укладки и 10-12% в разделяющем геле), метиленбисакриламид в качестве сшивающего агента, буфер для накопления или разделения геля, вода и SDS.. При добавлении катализатора TEMED и радикального инициатора персульфата аммония (APS) начинается полимеризация. Затем раствор заливается между стеклянными пластинами, не создавая пузырей. В зависимости от количества катализатора и радикального стартера и в зависимости от температуры полимеризация длится от четверти часа до нескольких часов. Сначала наливают нижний гель (разделяющий гель) и покрывают его несколькими каплями труднорастворимого в воде спирта (обычно насыщенного буфером бутанола или изопропанола), который удаляет пузырьки из мениска и защищает раствор геля. акцептора радикалов кислорода. После полимеризации разделяющего геля спирт удаляют, а остаточный спирт удаляют с помощью фильтровальной бумаги. После добавления APS и TEMED к раствору накопительного геля его выливают поверх твердого разделительного геля. После этого между стеклянными пластинами вставляется подходящая гребенка для образцов без образования пузырей. Гребень для образца осторожно вынимают после полимеризации, оставляя карманы для нанесения образца. Для последующего использования белков для секвенирования белков гели часто готовят за день до электрофореза, чтобы уменьшить реакции неполимеризованного акриламида с цистеинами в белках.
Используя a, можно отливать градиентные гели с градиентом акриламида (обычно от 4 до 12%), которые имеют больший диапазон разделения молекулярных масс. В коммерческих гелевых системах (так называемые предварительно отлитые гели) обычно используется буферное вещество бис-трис-метан со значением pH от 6,4 до 7,2 как в штабелеобразном геле, так и в разделяющем геле. Эти гели поставляются в литом виде и готовы к использованию. Поскольку они используют только один буфер () и имеют почти нейтральный pH, их можно хранить в течение нескольких недель. Более нейтральный pH замедляет гидролиз и, следовательно, разложение полиакриламида. Кроме того, в белках содержится меньше цистеинов, модифицированных акриламидом. Благодаря постоянному pH в собирающем и разделяющем геле эффект складывания отсутствует. Белки в гелях Бистрис не окрашиваются комплексами рутения. Эта гелевая система имеет сравнительно большой диапазон разделения, который можно варьировать, используя MES или MOPS в рабочем буфере.
Восстановление дисульфидов за счет DTT Во время подготовки образца буфер для образца и, следовательно, SDS, добавляется в избытке к белкам, а затем образец нагревается до 95 ° C в течение пяти минут или, альтернативно, до 70 ° C в течение десяти минут. Нагревание разрушает вторичную и третичную структуру белка за счет разрыва водородных связей и растяжения молекул. Необязательно, дисульфидные мостики могут быть отщеплены восстановлением. Для этой цели восстанавливают тиолы, такие как β-меркаптоэтанол (β-ME, 5% по объему), дитиотреитол (DTT, 10 миллимолярных) или дитиоэритрит (DTE, 10 ммоль) добавляют в буфер для образца. После охлаждения до комнатной температуры каждый образец пипеткой переносят в отдельную лунку в геле, который предварительно был погружен в буфер для электрофореза в аппарате для электрофореза.
В дополнение к образцам на гель обычно наносят маркер размера молекулярной массы . Он состоит из белков известных размеров и, таким образом, позволяет оценить (с ошибкой ± 10%) размеры белков в реальных образцах, которые мигрируют параллельно по разным дорожкам геля. Маркер размера часто вводится пипеткой в первый или последний карман геля.
Камера для электрофореза после нескольких минут электрофореза. В первый карман наносили маркер размера с бромфеноловым синим, в другие карманы добавляли образцы бромкрезоловый зеленый Для разделения денатурированные образцы наносили на гель полиакриламида, который подвергали электрофорезу. буфер с подходящими электролитами. После этого прикладывается напряжение (обычно около 100 В, 10-20 В на см длины геля), которое вызывает миграцию отрицательно заряженных молекул через гель в направлении положительно заряженного анода .. Гель действует как сито. Небольшие белки относительно легко перемещаются через сетку геля, тогда как более крупные белки с большей вероятностью будут удерживаться и, таким образом, более медленно мигрируют через гель, что позволяет разделить белки по размеру молекул. Электрофорез длится от получаса до нескольких часов в зависимости от напряжения и длины используемого геля.
Белки с самой быстрой миграцией (с молекулярной массой менее 5 кДа) образуют фронт буфера вместе с анионными компонентами буфера для электрофореза, которые также мигрируют через гель. Область передней части буфера становится видимой путем добавления сравнительно небольшого количества анионного красителя бромфенолового синего в буфер для образца. Из-за относительно небольшого размера молекулы бромфенолового синего он мигрирует быстрее, чем белки. Путем оптического контроля мигрирующей цветной полосы электрофорез можно остановить до того, как краситель полностью пройдет через гель и покинет его.
Наиболее часто используемый метод - это прерывистый SDS-PAGE. В этом методе белки сначала мигрируют в собирающий гель с нейтральным pH, в котором они концентрируются, а затем они мигрируют в разделяющий гель с основным pH, в котором и происходит фактическое разделение. Укладка и разделение гелей различаются разным размером пор (4-6% T и 10-20% T), ионной силой и значениями pH (pH 6,8 или pH 8,8). Наиболее часто используемым электролитом является SDS-содержащая система Трис -глицин -хлорид буфер. При нейтральном pH глицин преимущественно образует цвиттерионную форму, при высоком pH глицины теряют положительные заряды и становятся преимущественно анионными. В собирающем геле более мелкие отрицательно заряженные ионы хлорида мигрируют перед белками (как ведущие ионы), а несколько более крупные, отрицательно и частично положительно заряженные ионы глицината мигрируют за белками (как начальные замыкающие ионы), тогда как в сравнительно основной разделяющий гель: оба иона перемещаются впереди белков. Градиент pH между буферами накопительного геля и разделительного геля приводит к эффекту накопления на границе накопительного геля с разделительным гелем, так как глицинат частично теряет свои замедляющие положительные заряды по мере увеличения pH, а затем, как бывший замыкающий ион, обгоняет белков и становится ведущим ионом, из-за чего полосы различных белков (видимых после окрашивания) становятся более узкими и резкими - эффект наложения. Для разделения более мелких белков и пептидов используется буферная система TRIS- Tricine Шеггера и фон Ягова из-за более широкого распределения белков в диапазоне от 0,5 до 50 кДа.
10% гель трис / трицин, окрашенный кумасси. В левой полосе для оценки размера использовали маркер размера молекулярной массы (сверху вниз: 66, 45, 35, 24, 18 и 9 кДа). В оставшихся дорожках разделяли очищенные дрожжевые белки. В конце электрофоретического разделения все белки сортируются по размеру и затем могут быть проанализированы другими методами, например. г. окрашивание белков, такое как окрашивание Кумасси (наиболее распространенное и простое в использовании), окрашивание серебром (высшая чувствительность), окрашивает все окрашивание, амидо-черный 10B окрашивание, быстрое окрашивание зеленым FCF, флуоресцентные окрашивания, такие как окрашивание эпикоккононом и окрашивание SYPRO оранжевым, и иммунологическое обнаружение, такое как вестерн-блот. Флуоресцентные красители имеют сравнительно более высокую линейность между количеством белка и интенсивностью цвета, примерно на три порядка величины выше предела обнаружения, т.е. е. количество белка можно оценить по интенсивности окраски. При использовании флуоресцентного белкового красителя трихлорэтанол последующее окрашивание белка не проводится, если он был добавлен к раствору геля и гель был облучен УФ-светом после электрофореза.
In Coomassie Окрашивание, гель фиксируется в 50% этаноле и 10% растворе ледяной уксусной кислоты в течение 1 часа. Затем раствор заменяют на свежий, и через 1–12 часов гель заменяют на окрашивающий раствор (50% метанол, 10% ледяная уксусная кислота, 0,1% кумасси бриллиантовый синий) с последующим обесцвечиванием, меняя несколько раз обесцвечивающий раствор 40%. метанол, 10% ледяная уксусная кислота.
Окрашивание белков в геле создает документально подтвержденный рисунок полос различных белков. Гликопротеины имеют разные уровни гликозилирования и более неравномерно адсорбируют SDS при гликозилировании, что приводит к более широким и размытым полосам. Мембранные белки из-за их трансмембранных домена, часто состоят из более гидрофобных аминокислот, имеют более низкую растворимость в водных растворах, имеют тенденцию связывать липиды и склонны осаждаться в водных растворах из-за гидрофобные эффекты при отсутствии достаточного количества моющего средства. Это преципитация проявляется для мембранных белков в SDS-PAGE в «хвосте» над полосой трансмембранного белка. В этом случае можно использовать больше SDS (за счет использования более или более концентрированного буфера для образца) и уменьшить количество белка в приложении для образца. Перегрузка геля растворимым белком создает полукруглую полосу этого белка (например, в маркерной полосе изображения при 66 кДа), позволяя покрыть другие белки с аналогичными молекулярными массами. Низкий контраст (как на полосе маркера изображения) между полосами внутри полосы указывает либо на присутствие многих белков (низкая чистота), либо, если используются очищенные белки и низкий контраст наблюдается только ниже одной полосы, это указывает на протеолитическую деградацию. белка, который сначала вызывает полосы деградации, а после дальнейшей деградации дает однородный цвет («мазок») под полосой. Документирование рисунка полос обычно делается путем фотографирования или сканирования. Для последующего выделения молекул в отдельных полосах может быть проведена экстракция гелем .
Два геля SDS после завершения разделения образцов и окрашивания в рамке для сушки После окрашивания белков и документирования рисунка полос полиакриламидный гель можно высушить для архивного хранения. Позже из него можно будет извлечь белки. Гель помещают в сушильную раму (с использованием тепла или без него) или в вакуумную сушилку. Рамка для сушки состоит из двух частей, одна из которых служит основой для влажной целлофановой пленки, к которой добавлены гель и однопроцентный раствор глицерина. Затем накладывается вторая влажная целлофановая пленка без пузырьков, вторая часть рамки надевается сверху и рамка фиксируется зажимами. Удаление пузырьков воздуха позволяет избежать фрагментации геля во время сушки. Вода испаряется через целлофановую пленку. В отличие от сушильной рамы, вакуумная сушилка создает вакуум и нагревает гель примерно до 50 ° C.
Белки маркера размера (черный X) показывают приблизительно прямую линию в представлении log M над Rf. Молекулярная масса неизвестного белка (красный X) может быть определена по оси y. Для более точного определения молекулярной массы в разделяющем геле измеряются расстояния относительной миграции отдельных полос белка. Для повышения точности измерения обычно проводят в трех экземплярах. Относительная подвижность (называемая значением Rf или значением Rm) представляет собой частное от расстояния полосы белка и расстояния до фронта буфера. Расстояния полос и фронт буфера измеряются от начала разделительного геля. Расстояние до фронта буфера примерно соответствует расстоянию до бромфенолового синего, содержащегося в буфере для образца. Относительные расстояния между белками маркера размера нанесены на график полулогарифмически относительно их известных молекулярных масс. Путем сравнения с линейной частью сгенерированного графика или с помощью регрессионного анализа молекулярная масса неизвестного белка может быть определена по его относительной подвижности. Полосы белков с гликозилированием могут быть размытыми. Белки со многими основными аминокислотами (например, гистоны ) могут приводить к завышению молекулярной массы или даже не мигрировать в гель вообще, потому что при электрофорезе они перемещаются медленнее из-за положительных зарядов или даже из-за противоположное направление. Соответственно, многие кислые аминокислоты могут привести к ускоренной миграции белка и недооценке его молекулярной массы.
SDS-PAGE в сочетании с белковой окраской широко используется в биохимии. для быстрого и точного разделения и последующего анализа белков. У него сравнительно низкие затраты на приборы и реагенты, и он является простым в использовании методом. Из-за его низкой масштабируемости он в основном используется для аналитических целей и меньше для препаративных целей, особенно когда необходимо выделить большие количества белка.
Кроме того, SDS-PAGE используется в сочетании с вестерн-блоттингом для определения присутствия определенного белка в смеси белков или для анализа после -переводные модификации. Посттрансляционные модификации белков могут приводить к другой относительной подвижности (т. Е. Сдвигу полосы) или к изменению связывания детектирующего антитела, используемого в вестерн-блоттинге (т.е. полоса исчезает или появляется).
В масс-спектрометрии белков SDS-PAGE является широко используемым методом подготовки проб перед спектрометрией, в основном с использованием расщепления в геле. Что касается определения молекулярной массы белка, SDS-PAGE немного более точен, чем аналитическое ультрацентрифугирование, но менее точен, чем масс-спектрометрия или - игнорирование посттрансляционного модификации - расчет молекулярной массы белка по последовательности ДНК.
В медицинской диагностике SDS-PAGE используется как часть теста на ВИЧ и для оценки протеинурии. В тесте на ВИЧ белки ВИЧ разделяются с помощью SDS-PAGE и затем обнаруживаются с помощью вестерн-блоттинга с ВИЧ-специфическими антителами пациента, если они присутствуют в его сыворотке крови. SDS-PAGE для протеинурии оценивает уровни различных веществ в моче, например Альбумин, Альфа-2-макроглобулин и IgG.
SDS-PAGE является наиболее широко используемым методом гель-электрофоретического разделения белков. Двумерный гель-электрофорез последовательно объединяет изоэлектрическое фокусирование или ВАС-ПААГ с SDS-ПААГ. Native PAGE используется, если необходимо сохранить укладку природного белка. Для разделения мембранных белков BAC-PAGE или CTAB-PAGE можно использовать в качестве альтернативы SDS-PAGE. Для электрофоретического разделения более крупных белковых комплексов можно использовать электрофорез в агарозном геле, например SDD-AGE. Некоторые ферменты могут быть обнаружены по их активности ферментов с помощью зимографии.
Хотя они являются одним из наиболее точных и недорогих способов разделения белков и методы анализа, SDS-PAGE денатурирует белки. Если необходимы неденатурирующие условия, белки разделяют с помощью нативного PAGE или других хроматографических методов с последующим фотометрическим количественным определением, например аффинной хроматографией (или даже тандемная аффинная очистка ), эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография. Белки также могут быть разделены по размеру при фильтрации с тангенциальным потоком или ультрафильтрации. Отдельные белки могут быть выделены из смеси с помощью аффинной хроматографии или анализа с обратным отсчетом. Некоторые исторически ранние и экономически эффективные, но грубые методы разделения, обычно основанные на серии экстракций и осаждения с использованием космотропных молекул, например осаждение сульфатом аммония и осаждение полиэтиленгликоля.
В 1948 году Арне Тизелиус был удостоен Нобелевской премии по химии за открытие принципа электрофореза как миграции заряженных и растворенные атомы или молекулы в электрическом поле. Использование твердой матрицы (первоначально бумажных дисков) в зонном электрофорезе улучшило разделение. Прерывистый электрофорез 1964 г., проведенный Л. Орнштейном и Б. Дж. Дэвисом, позволил улучшить разделение за счет эффекта суммирования. Использование сшитых полиакриламидных гидрогелей, в отличие от ранее использовавшихся бумажных дисков или крахмальных гелей, обеспечило более высокую стабильность геля и отсутствие микробного разложения. Денатурирующий эффект SDS в непрерывных полиакриламидных гелях и последующее улучшение разрешения были впервые описаны в 1965 г. в рабочей группе Джеймса Э. Дарнелла для разделения белков полиовируса. Текущий вариант SDS-PAGE был описан в 1970 году Ulrich K. Laemmli и первоначально использовался для характеристики белков в головке бактериофага T4. Эта статья Лэммли широко цитируется как изобретение современного SDS-PAGE, но на самом деле этот метод был изобретен Джейком Майзелем, который проводил академический отпуск в лаборатории MRC, когда Лэммли присоединился к лаборатории в качестве постдокторанта. Майзель поделился своей предыдущей технологией с Лэммли, и вместе они внесли дальнейшие улучшения. Лэммли и Майзель планировали продолжить работу с докладом о методах, но этого не произошло. Майзель излагает историю развития SDS-PAGE в кратких комментариях.
