Фрагментация ДНК

Разделение или разрыв цепей ДНК на части

Фрагментация ДНК - это разделение или разрыв ДНК пряди на кусочки. Это может быть сделано специально лабораторным персоналом или клетками, или может произойти спонтанно. Спонтанная или случайная фрагментация ДНК - это фрагментация, которая постепенно накапливается в клетке. Его можно измерить, например, анализ комет или анализ TUNEL.

Мужчины с дефектами подвижности сперматозоидов часто имеют высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов. Степень фрагментации ДНК в сперматозоидах может предсказать результаты экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и его увеличения интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов (ИКСИ). И тест (SCD), и TUNEL assay эффективны для обнаружения повреждений ДНК сперматозоидов. При использовании светлопольной микроскопии тест SCD оказывается более чувствительным, чем тест TUNEL.

Его основные единицы измерения - это индекс фрагментации ДНК (DFI). DFI, равный 20% или более, значительно снижает вероятность успеха после ИКСИ.

Фрагментация ДНК была впервые задокументирована Уильямсоном в 1970 году, когда он наблюдал дискретные олигомерные фрагменты, возникающие во время гибели клеток в первичных культурах печени новорожденных. Он описал цитоплазматическую ДНК, выделенную из клеток печени мыши после культивирования, которая характеризовалась фрагментами ДНК с молекулярной массой, кратной 135 кДа. Это открытие согласуется с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК были специфическим продуктом деградации ядерной ДНК.

• 1 Преднамеренное
• 2 Спонтанное
• 3 Использование
• 4 Ссылки

Фрагментация ДНК часто необходима перед конструированием библиотеки или субклонированием последовательностей ДНК. В тех случаях, когда ДНК фрагментируется лабораторным персоналом, использовались различные методы, включающие механический разрыв ДНК. К таким методам относятся обработка ультразвуком, сдвиг иглой, распыление, сдвиг острием и прохождение через камеру давления.

• Рестрикционный гидролизат - это преднамеренное лабораторное разрушение цепей ДНК. Это обработка на основе ферментов, используемая в биотехнологии для разрезания ДНК на более мелкие нити с целью изучения различий в длине фрагментов между людьми или для клонирования генов. Этот метод фрагментирует ДНК либо за счет одновременного расщепления обеих цепей, либо за счет образования разрывов на каждой цепи дцДНК с образованием разрывов дцДНК.
• Акустический сдвиг передачи высокочастотных акустических энергетических волн, доставляемых к ДНК библиотека. Датчик имеет форму чаши, так что волны сходятся в интересующей цели.
• Распыление проталкивает ДНК через небольшое отверстие в блоке небулайзера, что приводит к образованию тонкого тумана, который собрано. Размер фрагмента определяется давлением газа, используемого для проталкивания ДНК через распылитель, скоростью, с которой раствор ДНК проходит через отверстие, вязкостью раствора и температурой.
• Обработка ультразвуком, a Тип гидродинамического сдвига, подвергает ДНК акустической кавитации и гидродинамическому сдвигу путем воздействия коротких периодов обработки ультразвуком, что обычно приводит к фрагментам размером 700 пар оснований. Для фрагментации ДНК обработка ультразвуком обычно применяется во время взрывных циклов с использованием ультразвукового устройства зондового типа.
• Сдвиг «точечный наклон», тип гидродинамического сдвига, использует шприцевой насос для создания гидродинамических сил сдвига путем проталкивания библиотеки ДНК через небольшое резкое сокращение. Около 90% длины фрагментов попадают в двукратный диапазон.
• Сдвиг иглы создает силы сдвига, пропуская библиотеки ДНК через иглу малого диаметра. ДНК проходит через калибровочную иглу несколько раз, чтобы физически разорвать ДНК на мелкие кусочки.
• Французские клетки давления пропускают ДНК через узкий клапан под высоким давлением, создавая высокие силы сдвига. С помощью французского пресса усилие сдвига можно точно регулировать, регулируя давление поршня. Пресс обеспечивает однократный проход через точку максимальной силы сдвига, ограничивая повреждение хрупких биологических структур из-за повторяющегося сдвига, как это происходит в других методах разрушения.
• При фрагментации, опосредованной транспозомами (мечения), транспосомы получают с ДНК который затем разрезается, так что события транспозиции приводят к фрагментированной ДНК с адаптерами (вместо вставки). Относительная концентрация транспосом и ДНК должна быть подходящей.

апоптотическая фрагментация ДНК - это естественная фрагментация, которую клетки выполняют при апоптозе (запрограммированной гибели клеток). Фрагментация ДНК является биохимическим признаком апоптоза. В умирающих клетках ДНК расщепляется эндонуклеазой, которая фрагментирует хроматин на нуклеосомные единицы, которые кратны примерно 180 п.н. олигомерам и проявляются в виде лестницы ДНК при прохождении через агарозный гель. Фермент, ответственный за апоптотическую фрагментацию ДНК, - это ДНКаза, активируемая каспазой. CAD обычно ингибируется другим белком, ингибитором ДНКазы, активируемой каспазой (ICAD). Во время апоптоза эффекторная каспаза апоптоза, каспаза 3, расщепляет ICAD и, таким образом, вызывает активацию CAD.

A нуклеосома, состоящая из ДНК (серый цвет), обернутой вокруг гистона тетрамера (цветной). При апоптотической фрагментации ДНК ДНК расщепляется в области межнуклеосомного линкера, которая является частью ДНК, не обернутой вокруг гистонов.

CAD расщепляет ДНК в сайтах межнуклеосомного линкера между нуклеосомами, белковые структуры, которые встречаются в хроматине с интервалами ~ 180 п.н. Это связано с тем, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистонов, основных белков нуклеосом. Сайты линкера - единственные части цепи ДНК, которые открыты и, следовательно, доступны для CAD.

Фрагментация ДНК играет важную роль в судебной экспертизе, особенно при профилировании ДНК.

• Полиморфизм длины рестрикционного фрагмента (RFLP) - это метод анализа переменной длины фрагментов ДНК, полученных в результате переваривания образца ДНК эндонуклеазой рестрикции. Эндонуклеаза рестрикции разрезает ДНК по определенной последовательности, известной как сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции. Присутствие или отсутствие определенных сайтов узнавания в образце ДНК приводит к образованию фрагментов ДНК различной длины, которые разделяют с помощью гель-электрофореза. Затем их гибридизуют с ДНК-зондами, которые связываются с комплементарной последовательностью ДНК в образце.
• В анализе полимеразной цепной реакции (ПЦР) создаются миллионы точных копий ДНК из биологического образца. Он использовался для амплификации определенной области цепи ДНК (мишени ДНК). Большинство методов ПЦР обычно амплифицируют фрагменты ДНК размером от 0,1 до 10 кг пар оснований (т.п.н.), хотя некоторые методы позволяют амплифицировать фрагменты размером до 40 т.п.н. ПЦР также использует тепло для разделения цепей ДНК.
• ДНК, фрагментированная во время апоптоза, размером от 1 до 20 нуклеосом, может быть выборочно выделена из клеток, зафиксированных в денатурирующем фиксирующем этаноле