Войти
Апоптотическая фрагментация ДНК, визуализированная с помощью лестничного анализа ДНК (слева). 1 kb маркер (посередине) и контрольная ДНК (справа) включены для сравнения. Апоптотическая фрагментация ДНК является ключевой особенностью апоптоз, тип запрограммированной гибели клеток. Апоптоз характеризуется активацией эндогенных эндонуклеаз, в частности ДНКазы, активируемой каспазой-3 (CAD), с последующим расщеплением ядерной ДНК на межнуклеосомные фрагменты примерно из 180 пар оснований. (п.н.) и их кратные (360, 540 и т. Д.). Апоптотическая фрагментация ДНК используется в качестве маркера апоптоза и для идентификации апоптозных клеток либо с помощью анализа ДНК-лестницы, анализа TUNEL, либо путем обнаружения клеток с фракционной ДНК. содержание («sub G 1 клеток») на гистограммах частоты содержания ДНК, например как в анализе Николетти.
Фермент, ответственный за апоптотическую фрагментацию ДНК, представляет собой Cаспазу- A активированную D назу (CAD). CAD обычно ингибируется другим белком, Iингибитором C аспазы A, активированной D Nase (ICAD). Во время апоптоза эффекторная каспаза апоптоза каспаза-3 расщепляет ICAD и, таким образом, вызывает активацию CAD.
A нуклеосома, состоящая из ДНК (серый цвет), обернутой вокруг гистона тетрамер (окрашенный). При апоптотической фрагментации ДНК ДНК расщепляется в области межнуклеосомного линкера, которая является частью ДНК, не обернутой вокруг гистонов. CAD расщепляет ДНК в сайтах межнуклеосомного линкера между нуклеосомами, белковосодержащими структурами, которые встречаются в хроматине с интервалами ~ 180 пар оснований. Это связано с тем, что ДНК обычно плотно обернута вокруг гистонов, белков ядра нуклеосом. Сайты линкера - единственные части цепи ДНК, которые открыты и, следовательно, доступны для CAD.
Распад ядерной ДНК на нуклеосомные единицы - один из признаков апоптотической гибели клетки. Это происходит в ответ на различные стимулы апоптоза в самых разных типах клеток. Молекулярная характеристика этого процесса позволила идентифицировать специфическую ДНКазу (CAD, активируемую каспазой ДНКазу), которая расщепляет хромосомную ДНК каспазозависимым образом. CAD синтезируется с помощью ICAD (ингибитор CAD), который работает как специфический шаперон для CAD и обнаруживается в комплексе с ICAD в пролиферирующих клетках. Когда клетки подвергаются апоптозу, каспаза 3 расщепляет ICAD для диссоциации комплекса CAD: ICAD, позволяя CAD расщеплять хромосомную ДНК. Таким образом, клетки, у которых отсутствует ICAD или которые экспрессируют мутантный ICAD, устойчивый к каспазам, не демонстрируют фрагментацию ДНК во время апоптоза, хотя они действительно проявляют некоторые другие признаки апоптоза и погибают.
Несмотря на то, что было выполнено много работы по анализу апоптотических событий, имеется мало информации, чтобы связать временные рамки морфологических особенностей на поверхности клетки и в ядре с биохимической деградацией ДНК в одних и тех же клетках. Апоптоз может быть инициирован множеством различных механизмов в разных типах клеток, и кинетика этих событий широко варьируется, от нескольких минут до нескольких дней в зависимости от клеточной системы. Наличие или отсутствие определенного апоптотического события (событий), включая фрагментацию ДНК, зависит от «временного окна», в котором исследуется кинетический процесс апоптоза. Часто это может усложнить идентификацию апоптотических клеток, если популяции клеток анализируются только в один момент времени, например. после индукции апоптоза.
Открытие межнуклеосомной фрагментации геномной ДНК на регулярные повторяющиеся олигонуклеосомные фрагменты, генерируемые Ca / Mg-зависимой эндонуклеазой, принято как один из наиболее хорошо охарактеризованных биохимических маркеров апоптоз (запрограммированная гибель клеток).
В 1970 году Уильямсон описал, что цитоплазматическая ДНК, выделенная из клеток печени мыши после культивирования, характеризовалась фрагментами ДНК с молекулярной массой, кратной 135 кДа. Это открытие согласуется с гипотезой о том, что эти фрагменты ДНК были специфическим продуктом деградации ядерной ДНК. В 1972 году Керр, Уилли и Карри ввели термин апоптоз и на основании морфологических особенностей отличили этот тип гибели клеток от некроза. В 1973 г. Хьюиш и Бургойн при изучении структуры субхроматина обнаружили, что хроматин доступен для Ca / Mg-эндонуклеазы, что привело к образованию продукта переваривания с регулярным рядом молекулярных масс, аналогичных один ранее описанный Уильямсоном (1970). В 1974 г. Уильямс, Литтл и Шипли, используя клетки, подвергшиеся самым разным типам травм, обнаружили, что во время гибели клетки деградированная ДНК "в каждом случае имела модальное значение между 10 (x6) и 10 (x7) Дальтон и клеточный метаболизм необходимы для разложения ДНК ». Однако это наблюдение не указывало на то, «была ли атака с разрезом на молекулу ДНК случайной или, скорее, на конкретном участке, имеющем структурное или функциональное значение». В 1976 г. Скалка, Матясова и Цейкова описали межнуклеосомную фрагментацию ДНК облученного лимфоидного хроматина in vivo.
Прошло шесть лет с 1972 по 1978/1980 гг. До открытия и оценки межнуклеосомная фрагментация ДНК во время апоптотической гибели клеток как признак апоптоза. С 1972 г. (Керр, Уилли и Карри) принято, что гибель лимфоцитов, вызванная глюкокортикоидами, является формой апоптоза. В 1978 г. Захарян и Погосян представили доклад, в котором было показано, что индуцированная глюкокортикоидами деградация ДНК в лимфоидной ткани, тимусе и селезенке крыс происходила по определенной схеме, давая фрагменты ДНК, которые были электрофоретически подобны тем, которые наблюдались после лечения хроматин с микрококковой нуклеазой, что указывает на межнуклеосомный характер расщепления ДНК, происходящей во время апоптоза. Таким образом, была обнаружена первая связь между запрограммированной гибелью клеток / апоптозом и межнуклеосомной фрагментацией ДНК хроматина, которая вскоре стала характерной особенностью апоптоза.
В 1980 году Уилли сообщил о дополнительных доказательствах паттерна межнуклеосомного расщепления ДНК как специфической особенности обработанных глюкокортикоидами тимоцитов, подвергающихся апоптозу. Характер межнуклеосомного расщепления ДНК наблюдался как специфический признак апоптоза в 1978/1980 годах и с тех пор стал признанным признаком запрограммированной гибели клеток. В 1992 году Gorczyca et al. и Гавриэли и др. независимо описал анализ фрагментации ДНК, основанный на использовании концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы (TUNEL ), который стал одним из стандартных методов обнаружения и идентификации апоптозных клеток.
Проточная цитометрия наиболее часто используется для обнаружения апоптотической фрагментации ДНК. Анализ содержания ДНК с помощью проточной цитометрии может идентифицировать апоптотические клетки с фрагментированной ДНК как клетки с фракционным содержанием ДНК, часто называемые клетками sub-G 1. Проточно-цитометрический анализ с использованием флуорохрома акридинового оранжевого показывает, что фрагментация ДНК в отдельных клетках является прерывистой, вероятно, отражая разные уровни ограничения доступа ДНК к ДНКазе наднуклеосомным и нуклеосомным уровнями структуры хроматина. Присутствие апоптотических «клеток суб-G 1 » также может быть обнаружено в клетках, предварительно зафиксированных в этаноле, но не после фиксации в сшивающих фиксаторах, таких как формальдегид. Поздние апоптотические клетки S и G 2 могут быть не обнаружены с помощью этого подхода, поскольку их фракционное содержание ДНК может перекрываться с содержанием неапоптотических клеток G 1. Обработка клеток детергентом, до или одновременно с флуорохромом ДНК, также выявляет фрагментацию ДНК в силу присутствия клеток или фрагментов суб-G 1, как определено Николетти и др.
Апоптотическая фрагментация ДНК также может быть обнаружена с помощью анализа TUNEL. Анализ TUNEL на основе флуорохрома, применимый для проточной цитометрии, коррелирует обнаружение разрывов цепей ДНК с содержанием клеточной ДНК и, таким образом, с положением фазы клеточного цикла. Тест TUNEL для мечения авидин-пероксидазой применим для светопоглощающей микроскопии. Многие комплекты, относящиеся к TUNEL, коммерчески доступны. Апоптотическая фрагментация ДНК также анализируется с использованием агарозного геля электрофореза для демонстрации «лестничной» картины с интервалами ~ 180 п.н.. Некроз, с другой стороны, обычно характеризуется случайной фрагментацией ДНК, которая образует «мазок» на агарозных гелях.
