Войти
Бактериальный сферопласт исправлен стеклянной пипеткой 
Запись тока патч-зажимом показывает переходы между двумя состояния проводимости одиночного ионного канала: закрытый (вверху) и открытый (внизу). метод фиксации патча - это лабораторный метод в электрофизиологии используется для изучения ионных токов в отдельных изолированных живых клетках, срезах тканей или участках клеточной мембраны. Этот метод особенно полезен при изучении возбудимых клеток, таких как нейроны, кардиомиоциты, мышечные волокна и панкреатические бета. клеток, а также может применяться для исследования бактериальных ионных каналов в специально подготовленных гигантских сферопластах.
Зажимание участка может выполняться с использованием метода фиксации напряжения. В этом случае напряжение на клеточной мембране контролируется экспериментатором, и результирующие токи регистрируются. В качестве альтернативы можно использовать метод токовых клещей . В этом случае ток, проходящий через мембрану, контролируется экспериментатором, и результирующие изменения напряжения регистрируются, как правило, в форме потенциалов действия.
Эрвин Неер и Берт Сакманн разработали патч-зажим в конце 1970-х - начале 1980-х годов. Это открытие позволило впервые регистрировать токи молекул одиночных ионных каналов, что улучшило понимание участия каналов в фундаментальных клеточных процессах, таких как потенциалы действия и нервная активность. За эту работу Неер и Сакманн получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1991 году.
Классическая установка патч-зажима с микроскопом , антивибрационный стол и микроманипуляторы Во время записи с зажимом патч - полая стеклянная трубка, известная как микропипетка или патч-пипетка, заполненная раствором электролита, и записывающий электрод , подключенный к усилителю, приводится в контакт с мембраной изолированной ячейки. Другой электрод помещают в ванну, окружающую клетку или ткань, в качестве электрода сравнения заземления. Электрическая цепь может быть сформирована между записывающим электродом и электродом сравнения с интересующей ячейкой между ними.
Схематическое изображение съемника для пипеток, используемого для подготовки микропипеток для патч-зажима и других записей 
Цепь, образованная во время цельноклеточного или перфорированного патч-зажима Раствор, заполняющий патч-пипетку, может соответствовать ионному составу ванны раствора, как в случае записи с прикрепленными клетками, или сопоставить цитоплазму для записи целых клеток. Раствор в ванне может соответствовать физиологическому внеклеточному раствору, цитоплазме или быть полностью нефизиологическим, в зависимости от эксперимента, который предстоит провести. Исследователь также может изменить содержание раствора для ванны (или, реже, раствора для пипетки), добавляя ионы или лекарства для изучения ионных каналов в различных условиях.
В зависимости от того, что исследователь пытается измерить, диаметр используемого наконечника пипетки может варьироваться, но обычно он находится в диапазоне микрометра. Этот небольшой размер используется для ограждения клеточной мембраны площади поверхности или «участка», который часто содержит только одну или несколько молекул ионных каналов. Этот тип электрода отличается от «острого микроэлектрода», используемого для прокалывания клеток в традиционных внутриклеточных записях, тем, что он запечатан на поверхности клеточной мембраны, а не вставлен через нее.
Типичное оборудование, используемое во время классической записи с фиксацией патч-зажима В некоторых экспериментах кончик микропипетки нагревается в микропипетке для получения гладкой поверхности, которая помогает в формировании уплотнения с высоким сопротивлением клеточной мембраной. Чтобы получить это уплотнение с высоким сопротивлением, микропипетка прижимается к клеточной мембране и применяется отсос. Часть клеточной мембраны всасывается в пипетку, образуя область мембраны в форме омега, которая при правильном формировании создает сопротивление в диапазоне 10–100 гигаом, называемое "гигаомное уплотнение" или "гигаомное уплотнение". Высокое сопротивление этого уплотнения позволяет с помощью электроники изолировать токи, измеряемые через участок мембраны, с небольшим шумом, а также обеспечивает некоторую механическую стабильность записи.
Зажим нервной клетки в срезе ткани мозга. Пипетка на фотографии отмечена голубым цветом. Многие усилители с коммутационным зажимом не используют настоящую схему зажима напряжения, а вместо этого представляют собой дифференциальные усилители, в которых используется ванна электрод для установки уровня нулевого тока (заземления). Это позволяет исследователю поддерживать постоянное напряжение, наблюдая за изменениями тока. Чтобы сделать эти записи, патч-пипетка сравнивается с заземляющим электродом. Затем в систему подается ток для поддержания постоянного установленного напряжения. Ток, который необходим для ограничения напряжения, противоположен по знаку и равен по величине току через мембрану.
В качестве альтернативы, ячейка может быть ограничена по току в режиме всей ячейки, поддержание постоянного тока при наблюдении за изменениями в мембранном напряжении.
Диаграмма, показывающая варианты метода патч-зажима В зависимости от того, что исследователь хочет изучить, могут быть применены несколько вариантов базовой техники. Методы «наизнанку-наружу» и «наружу-наружу» называются методами «вырезанного пятна», потому что пластырь вырезается (удаляется) из основной части клетки. Методы прикрепления к клеткам и иссечения обоих пластырей используются для изучения поведения отдельных ионных каналов в части мембраны, прикрепленной к электроду.
Пластырь целой клетки и пластырь с перфорацией позволяют исследователю изучать электрическое поведение всей клетки вместо одиночных токов канала. Цельноклеточный пластырь, который обеспечивает электрический доступ с низким сопротивлением внутрь клетки, в настоящее время в значительной степени заменил методы записи с использованием высокоомных микроэлектродов для регистрации токов через всю клеточную мембрану.
Конфигурация прикрепленного к клетке пластыря Для этого метода пипетка запаяна на клеточной мембране, чтобы получить гигазу, при этом гарантируя, что клеточная мембрана остается неповрежденной. Это позволяет регистрировать токи через один или несколько ионных каналов, содержащихся в участке мембраны, захваченном пипеткой. Прикрепляясь только к внешней части клеточной мембраны, структура клетки практически не нарушается. Кроме того, если не нарушать внутреннюю часть клетки, любые внутриклеточные механизмы, обычно влияющие на канал, по-прежнему смогут функционировать так, как они будут физиологически. Используя этот метод, также относительно легко получить правильную конфигурацию, и после получения она является достаточно стабильной.
Для ионных каналов, управляемых лигандом, или каналов, которые модулируются метаботропными рецепторы, нейромедиатор или исследуемый препарат обычно включаются в раствор для пипетки, где он может взаимодействовать с тем, что раньше было внешней поверхностью мембраны. Результирующая активность канала может быть связана с используемым лекарственным средством, хотя обычно невозможно затем изменить концентрацию лекарственного средства внутри пипетки. Таким образом, метод ограничен одной точкой на кривой доза-ответ на пластырь. Следовательно, доза-реакция достигается с использованием нескольких ячеек и пластырей. Однако потенциалзависимые ионные каналы могут быть зажаты последовательно при различных мембранных потенциалах в одном участке. Это приводит к активации канала как функции напряжения, и полная кривая I-V (ток-напряжение) может быть установлена только в одном фрагменте. Другой потенциальный недостаток этого метода состоит в том, что, поскольку внутриклеточные пути клетки не нарушены, они также не могут быть изменены напрямую.
Конфигурация пластыря наизнанку В при методе «наизнанку наружу» пластырь мембраны прикрепляется к пипетке с пластырем, отделяется от остальной части клетки, и цитозольная поверхность мембраны подвергается воздействию внешней среды или ванны. Одним из преимуществ этого метода является то, что экспериментатор имеет доступ к внутриклеточной поверхности мембраны через ванну и может изменять химический состав того, чему подвергается поверхность мембраны. Это полезно, когда экспериментатор желает управлять окружающей средой на внутриклеточной поверхности одиночных ионных каналов. Например, каналы, которые активируются внутриклеточными лигандами, затем могут быть изучены с помощью диапазона концентраций лиганда.
Для достижения конфигурации «наизнанку наружу» пипетка прикрепляется к клеточной мембране, как в режиме присоединения к клетке, образуя гигазу, а затем втягивается, чтобы отделить участок мембраны от остальной части ячейка. Удаление мембранного пластыря часто сначала приводит к образованию пузырька мембраны в кончике пипетки, потому что концы пластыря быстро сливаются вместе после иссечения. Затем необходимо вскрыть внешнюю поверхность пузырька, чтобы перейти в режим наизнанку; это может быть сделано путем кратковременного проведения мембраны через границу раздела раствор / воздух в ванне, воздействия раствора с низким содержанием Ca или кратковременного контакта с каплей парафина или кусочком отвержденного силиконового полимера.
Конфигурация пластырей целых клеток Запись целых клеток включает запись токов по нескольким каналам одновременно, более большой участок клеточной мембраны. Электрод остается на ячейке, как и в записях, прикрепленных к ячейке, но применяется большее всасывание для разрыва мембранного пластыря, таким образом обеспечивая доступ изнутри пипетки во внутриклеточное пространство ячейки. Это дает возможность применять и изучать, как лечение (например, лекарства) может влиять на клетки в режиме реального времени. После того, как пипетка прикреплена к клеточной мембране, есть два метода сломать пластырь. Первый - усилить всасывание. Количество и продолжительность этого всасывания зависит от типа ячейки и размера пипетки. Другой метод требует, чтобы через пипетку пропускался большой импульс тока. Величина приложенного тока и длительность импульса также зависят от типа ячейки. Для некоторых типов клеток удобно применять оба метода одновременно, чтобы сломать пластырь.
Преимущество записи с фиксацией положения целой клетки перед записью методом острого электрода заключается в том, что большее отверстие на кончике электрода с фиксацией патча обеспечивает более низкое сопротивление и, следовательно, лучший электрический доступ внутрь ячейки. Недостатком этого метода является то, что, поскольку объем электрода больше, чем объем ячейки, растворимое содержимое внутри ячейки будет медленно заменяться содержимым электрода. Это называется электродом , «диализирующим» содержимое клетки. Через некоторое время любые свойства клетки, зависящие от растворимого внутриклеточного содержимого, изменятся. Используемый пипеточный раствор обычно приближается к среде с высоким содержанием калия внутри ячейки, чтобы минимизировать любые изменения, которые это может вызвать. Часто бывает период в начале записи всей клетки, когда можно проводить измерения до того, как клетка будет диализована.
Техника формирования пятна снаружи. По порядку: верхний левый, верхний правый, нижний левый, нижний правый. Название "снаружи-наружу" подчеркивает как дополняемость этой техники к технике изнутри-наружу, так и тот факт, что она размещает внешнее, а не внутриклеточная поверхность клеточной мембраны на внешней стороне пластыря мембраны по отношению к пластырю.
Формирование внешнего пластыря начинается с конфигурации записи для всей клетки. После того, как цельноклеточная конфигурация сформирована, электрод медленно извлекают из клетки, позволяя мембране пузырь выйти из клетки. Когда электрод отодвинут достаточно далеко, пузырек отсоединится от ячейки и превратится в выпуклую мембрану на конце электрода (как шар, открытый на кончике электрода), причем исходная часть мембраны будет обращена наружу от электрода. электрод. Как показано на изображении справа, это означает, что жидкость внутри пипетки будет имитировать внутриклеточную жидкость, в то время как исследователь может перемещать пипетку и пузырек с его каналами в другую ванну с раствором. Хотя в пузыре мембраны может существовать несколько каналов, запись по одному каналу также возможна в этой конформации, если пузырек отсоединившейся мембраны небольшой и содержит только один канал.
Заплатка извне дает экспериментатору возможность исследуют свойства ионного канала, когда он изолирован от клетки и последовательно подвергается воздействию различных растворов на внеклеточной поверхности мембраны. Экспериментатор может перфузировать один и тот же пластырь различными растворами за относительно короткий промежуток времени, и если канал активируется нейротрансмиттером или лекарством из внеклеточного лица, доза-реакция Кривая тогда может быть получена. Эта способность измерять ток через один и тот же кусок мембраны в разных растворах является явным преимуществом внешнего пластыря по сравнению с методом прикрепления клеток. С другой стороны, сделать это труднее. Более длительный процесс формирования включает в себя больше шагов, которые могут потерпеть неудачу, и приводит к меньшей частоте используемых исправлений.
Техника перфорированной заплатки Этот вариант метода зажима заплатки очень похож на конфигурацию целых клеток. Основное различие заключается в том, что, когда экспериментатор формирует гигаомное уплотнение, отсасывание не используется для разрыва заплаты мембраны. Вместо этого электродный раствор содержит небольшие количества противогрибкового антибиотика агента, такого как амфотерицин-B, нистатин или грамицидин, который диффундирует в участок мембраны и образует в мембране небольшие поры, обеспечивая электрический доступ внутрь клетки. Сравнивая методы цельноклеточного и перфорированного пластыря, можно представить себе цельноклеточный пластырь как открытую дверь, в которой происходит полный обмен между молекулами раствора пипетки и цитоплазмой. Перфорированный пластырь можно сравнить с дверцей экрана, которая обеспечивает обмен только определенных молекул из раствора пипетки в цитоплазму клетки.
Преимущества метода перфорированного пластыря по сравнению с записями целых клеток включают свойства пор антибиотика, которые позволяют уравновешивать только небольшие одновалентные ионы между пипеткой-пластырем и цитозолем, но не более крупные молекулы, которые не может проникать через поры. Это свойство поддерживает эндогенные уровни двухвалентных ионов, таких как Са, и сигнальных молекул, таких как цАМФ. Следовательно, можно иметь записи всей клетки, как при зажимании участка целой клетки, при сохранении большинства внутриклеточных сигнальных механизмов, как в записях, связанных с клетками. В результате сокращается текущая остановка, и стабильная запись перфорированных патчей может длиться более одного часа. К недостаткам относится более высокое сопротивление доступу по сравнению с целой ячейкой из-за частичной мембраны, занимающей кончик электрода. Это может снизить текущее разрешение и увеличить шум записи. Также может потребоваться значительное время, чтобы антибиотик пробил мембрану (около 15 минут для амфотерицина-B и даже больше для грамицидина и нистатина). Мембрана под наконечником электрода ослаблена перфорациями, образованными антибиотиком, и может разорваться. Если пластырь разрывается, запись выполняется в режиме целой клетки, при этом антибиотик заражает внутреннюю часть клетки.
Техника незакрепленного пластыря Свободный пластырь-фиксатор отличается от других методы, обсуждаемые здесь, в том, что в них используется неплотное уплотнение (низкое электрическое сопротивление), а не герметичный гигабайт, используемый в традиционной технике. Этот метод использовался еще в 1961 году, как описано в статье Стрикхольма об импедансе поверхности мышечной клетки, но не получил особого внимания до тех пор, пока не был снова использован и назван Альмерсом, Стэнфилдом и Штюмером в 1982 году. после того, как патч-зажим стал основным инструментом электрофизиологии.
Чтобы получить свободный патч-зажим на клеточной мембране, пипетка медленно перемещается по направлению к ячейке, пока электрическое сопротивление контакта между ячейкой и пипеткой не возрастет до в несколько раз большего сопротивления, чем сопротивление только электрод. Чем ближе пипетка подходит к мембране, тем больше становится сопротивление наконечника пипетки, но если слишком близко, образуется уплотнение, и может стать трудным извлечь пипетку без повреждения ячейки. Для техники «рыхлого пластыря» пипетка не приближается к мембране достаточно близко, чтобы образовать гигазальное или постоянное соединение, а также не проткнуть клеточную мембрану. Клеточная мембрана остается неповрежденной, а отсутствие плотного уплотнения создает небольшой зазор, через который ионы могут проходить за пределы клетки, не попадая в пипетку.
Существенным преимуществом неплотного уплотнения является то, что используемую пипетку можно многократно снимать с мембраны после записи, и мембрана останется неповрежденной. Это позволяет проводить повторные измерения в различных местах одной и той же ячейки без нарушения целостности мембраны. Эта гибкость была особенно полезна исследователям для изучения мышечных клеток, когда они сокращаются в реальных физиологических условиях, для быстрого получения записей и без применения радикальных мер, чтобы остановить сокращение мышечных волокон. Основным недостатком является то, что сопротивление между пипеткой и мембраной значительно снижается, что позволяет току течь через уплотнение и значительно снижает разрешение малых токов. Однако эту утечку можно частично скорректировать, что дает возможность сравнивать и сравнивать записи, сделанные с разных областей на интересующей ячейке. Исходя из этого, было подсчитано, что метод свободной коммутации может разрешать токи менее 1 мА / см.
Недавно были разработаны системы автоматических коммутационных зажимов для сбора большие объемы данных недорого за более короткий период времени. Такие системы обычно включают одноразовое микрофлюидное устройство, либо отлитый под давлением, либо полидиметилсилоксановый (PDMS) литой чип для захвата клетки или клеток, и встроенный электрод.
В одной из форм такой автоматизированной системы перепад давления используется для принудительного притягивания исследуемых клеток к отверстию пипетки до тех пор, пока они не образуют гигазу. Затем, при кратковременном воздействии атмосферы на кончик пипетки, часть мембраны, выступающая из пипетки, лопается, и теперь мембрана находится в вывернутой наизнанку конформации на кончике пипетки. В полностью автоматизированной системе пипетка и мембранный пластырь могут затем быстро перемещаться через серию различных тестовых растворов, что позволяет наносить различные тестируемые соединения на внутриклеточную сторону мембраны во время записи.
