Войти
Фиксатор напряжения работает с помощью отрицательной обратной связи. мембранный потенциал усилитель измеряет мембранное напряжение и отправляет выходной сигнал на усилитель обратной связи; это вычитает мембранное напряжение из командного напряжения, которое он получает от генератора сигналов. Этот сигнал усиливается, и выходной сигнал отправляется в аксон через ток -пропускающий электрод.фиксатор напряжения - экспериментальный метод, используемый электрофизиологи для измерения иона токов через мембраны возбудимых клеток, таких как нейроны, удерживая мембрана напряжение на заданном уровне. Базовый зажим напряжения будет итеративно измерять мембранный потенциал, а затем изменять мембранный потенциал (напряжение) до желаемого значения, добавляя необходимый ток. Это «зажимает» клеточную мембрану желаемым постоянным напряжением, позволяя зажиму напряжения записывать, какие токи подаются. Поскольку токи, приложенные к ячейке, должны быть равны (и противоположны в charge to) току, проходящему через мембрану ячейки при заданном напряжении, зарегистрированные токи показывают, как ячейка реагирует на изменения мембранного потенциала. Клеточные мембраны возбудимых клеток содержат множество различных типов ионных каналов, некоторые из которых управляются напряжением. Зажим напряжения позволяет управлять напряжением мембраны независимо от ионных токов, позволяя изучать ток-напряжение отношений мембранных каналов.
Понятие напряжения Зажим приписывается Кеннету Коулу и весной 1947 года. Они вставили внутренний электрод в гигантский аксон кальмара и начали подавать ток. Коул обнаружил, что можно использовать два электрода и цепь обратной связи, чтобы поддерживать мембранный потенциал ячейки на уровне, установленном экспериментатор.
Коул разработал технику фиксации напряжения до эры микроэлектродов, поэтому его два электрода состояли из тонких проволок, скрученных вокруг изолирующего стержня . Поскольку электроды этого типа можно было вставить только в самые крупные клетки, первые электрофизиологические эксперименты проводились почти исключительно на аксонах кальмаров.
Личное фото Кеннета Коула, переданное доктору Дж. Уолтеру Вудбери. Кальмары брызгают струями воды, когда им нужно двигаться быстро, как при побеге от хищника. Чтобы сделать это бегство как можно быстрее, у них есть аксон , который может достигать 1 мм в диаметре (сигналы быстрее распространяются по большим аксонам). гигантский аксон кальмара был первым препаратом, который можно было использовать для ограничения напряжения трансмембранного тока, и он стал основой новаторских экспериментов Ходжкина и Хаксли по свойствам потенциала действия.
Алан Ходжкин понял, что для понимания потока ионов через мембрану необходимо устранить различия в мембранном потенциале. Используя эксперименты с фиксатором напряжения, Ходжкин и Эндрю Хаксли опубликовали летом 1952 года 5 статей, описывающих, как ионные токи вызывают потенциал действия. В заключительной статье была предложена модель Ходжкина – Хаксли, которая математически описывает потенциал действия. Использование токоизмерительных клещей в их экспериментах для детального изучения и моделирования потенциала действия заложило основу электрофизиологии ; за которые они разделили 1963 г. Нобелевскую премию по физиологии и медицине.
Токоизмерительные клещи - это генератор тока. Трансмембранное напряжение регистрируется через «электрод напряжения» относительно земли, и «токовый электрод» пропускает ток в ячейку. Экспериментатор устанавливает «удерживающее напряжение» или «командный потенциал», и фиксатор напряжения использует отрицательную обратную связь, чтобы поддерживать ячейку на этом напряжении. Электроды подключены к усилителю, который измеряет мембранный потенциал и подает сигнал в усилитель с обратной связью . Этот усилитель также получает входной сигнал от генератора сигналов, который определяет командный потенциал, и вычитает мембранный потенциал из командного потенциала (V command - V m), увеличивает любую разницу, и отправляет вывод на токовый электрод. Каждый раз, когда ячейка отклоняется от напряжения удержания, операционный усилитель генерирует «сигнал ошибки», то есть разность между командным потенциалом и фактическим напряжением ячейки. Схема обратной связи пропускает ток в ячейку, чтобы уменьшить сигнал ошибки до нуля. Таким образом, зажимная цепь производит ток, равный ионному току и противоположный ему.
Двухэлектродный фиксатор напряжения Для исследования используется двухэлектродный фиксатор напряжения (TEVC). свойства мембранных белков, особенно ионных каналов. Исследователи чаще всего используют этот метод для исследования мембранных структур, экспрессируемых в ооцитах Xenopus . Большой размер этих ооцитов позволяет легко обращаться с ними и манипулировать ими.
В методе TEVC используются две пипетки с низким сопротивлением, одна измеряет напряжение, а другая вводит ток. Микроэлектроды заполняются проводящим раствором и вставляются в ячейку для искусственного контроля мембранного потенциала. Мембрана действует как диэлектрик , а также как резистор , в то время как жидкости по обе стороны от мембраны действуют как конденсаторы. Микроэлектроды сравнивают мембранный потенциал с командным напряжением, обеспечивая точное воспроизведение токов, протекающих через мембрану. Текущие показания могут быть использованы для анализа электрического отклика ячейки на различные приложения.
Этому методу отдается предпочтение перед зажимом с одним микроэлектродом или другими методами фиксации напряжения, когда условия требуют разрешения больших токов. Высокая пропускная способность двухэлектродного зажима позволяет фиксировать большие токи, которые невозможно контролировать с помощью одноэлектродных методик. Двухэлектродная система также желательна из-за быстрого времени установления зажима и низкого уровня шума. Однако использование TEVC ограничено размером ячеек. Он эффективен для ооцитов большего диаметра, но его труднее использовать с мелкими клетками. Кроме того, метод TEVC ограничен тем, что датчик тока должен находиться в пипетке. Во время зажима невозможно манипулировать внутриклеточной жидкостью, что возможно с использованием методов зажима пластыря. Другой недостаток связан с проблемами "пространственного зажима". В зажиме напряжения Коула использовался длинный провод, который равномерно зажимал аксон кальмара по всей его длине. Микроэлектроды TEVC могут обеспечивать только пространственный точечный источник тока, который не может равномерно воздействовать на все части ячейки неправильной формы.
Метод двухэлементного фиксатора напряжения представляет собой специализированный вариант двухэлектродного фиксатора напряжения и используется только при исследовании щелевого перехода каналы. Щелевые соединения - это поры, которые напрямую связывают две клетки, через которые свободно протекают ионы и небольшие молекулы. Когда две клетки, в которых белки щелевых соединений, обычно коннексины или иннексины, экспрессируются либо эндогенно, либо посредством инъекции мРНК, между ними образуется канал соединения. клетки. Поскольку в системе присутствуют две ячейки, используются два набора электродов. Регистрирующий электрод и электрод для подачи тока вставляются в каждую ячейку, и каждая ячейка зажимается отдельно (каждый набор электродов присоединяется к отдельному устройству, а интегрирование данных выполняется компьютером). Для регистрации переходной проводимости в первой ячейке изменяется ток, в то время как записывающий электрод во второй ячейке регистрирует любые изменения V m только для второй ячейки. (Процесс может быть обращен вспять, если стимул возникает во второй ячейке, а запись происходит в первой ячейке.) Поскольку электрод в записываемой ячейке не вызывает изменения тока, любое изменение напряжения должно быть вызвано пересечением тока в записанная ячейка через каналы щелевого перехода от ячейки, в которой изменялся ток.
Эта категория описывает набор методов, в которых используется один электрод для зажима напряжения. Метод непрерывного одноэлектродного зажима (SEVC-c) часто используется с записью патч-зажима. Метод прерывистого одноэлектродного фиксирования напряжения (SEVC-d) используется с проникающей внутриклеточной записью. Этот единственный электрод выполняет функции как подачи тока, так и регистрации напряжения.
Метод «патч-зажим» позволяет исследовать отдельные ионные каналы. В нем используется электрод с относительно большим наконечником (>1 микрометра), который имеет гладкую поверхность (а не острый наконечник). Это «электрод с фиксатором» (в отличие от «острого электрода», используемого для прокалывания клеток). Этот электрод прижимается к клеточной мембране, и применяется всасывание, чтобы втягивать мембрану клетки внутрь наконечника электрода. Всасывание заставляет ячейку образовывать плотное уплотнение с электродом («гигаомное уплотнение», поскольку сопротивление составляет более гигаом ).
SEV-c имеет то преимущество, что вы можете записывать данные с небольших ячеек, которые невозможно пронзить двумя электродами. Однако:
Одноэлектродный фиксатор напряжения - прерывистый, или SEVC-d имеет некоторые преимущества перед SEVC-c для записи целых клеток. В этом случае используется другой подход к пропусканию тока и записи напряжения. Усилитель SEVC-d работает по принципу «с разделением времени », поэтому электрод регулярно и часто переключается между проходящим током и измеряемым напряжением. Фактически, имеется два электрода, но каждый работает только половину времени, в течение которого он включен. Колебание между двумя функциями одного электрода называется рабочим циклом. Во время каждого цикла усилитель измеряет мембранный потенциал и сравнивает его с удерживающим потенциалом. Операционный усилитель измеряет разницу и генерирует сигнал ошибки. Этот ток является зеркальным отображением тока, генерируемого ячейкой. Выходы усилителя имеют схемы выборки и удержания, поэтому каждое кратковременно измеренное напряжение затем удерживается на выходе до следующего измерения в следующем цикле. В частности, усилитель измеряет напряжение в первые несколько микросекунд цикла, генерирует сигнал ошибки и проводит оставшуюся часть цикла, пропуская ток, чтобы уменьшить эту ошибку. В начале следующего цикла снова измеряется напряжение, генерируется новый сигнал ошибки, пропускается ток и т. Д. Экспериментатор устанавливает длину цикла, и можно производить выборку с периодами примерно 15 микросекунд, что соответствует 67 кГц. частота коммутации. Частоты переключения ниже примерно 10 кГц недостаточно при работе с потенциалами действия шириной менее 1 миллисекунды. Обратите внимание, что не все усилители с прерывистым ограничением напряжения поддерживают частоты переключения выше 10 кГц.
Чтобы это работало, емкость ячейки должна быть выше емкости электрода как минимум на порядок. Емкость замедляет кинетику (время нарастания и спада) токов. Если емкость электрода намного меньше, чем у ячейки, то при пропускании тока через электрод напряжение электрода будет изменяться быстрее, чем напряжение ячейки. Таким образом, когда ток подается, а затем выключается (в конце рабочего цикла), напряжение электрода будет спадать быстрее, чем напряжение элемента. Как только напряжение электрода становится асимптотически равным напряжению ячейки, напряжение может быть измерено (снова) и приложена следующая величина заряда. Таким образом, частота рабочего цикла ограничена скоростью, с которой напряжение электрода растет и спадает при прохождении тока. Чем ниже емкость электрода, тем быстрее цикл.
SEVC-d имеет главное преимущество перед SEVC-c, позволяя экспериментатору измерять мембранный потенциал, и, поскольку он исключает прохождение тока и измерение напряжения одновременно, никогда не возникает ошибки последовательного сопротивления. Основные недостатки - ограниченное временное разрешение и нестабильность усилителя. Если он пропускает слишком большой ток, что приводит к превышению целевого напряжения, он меняет полярность тока в следующем рабочем цикле. Это приводит к снижению целевого напряжения, поэтому следующий цикл снова меняет полярность подаваемого тока. Эта ошибка может расти с каждым циклом, пока усилитель не выйдет из-под контроля («звенит»); это обычно приводит к разрушению записываемой ячейки. Исследователю нужен короткий рабочий цикл для улучшения временного разрешения; усилитель имеет регулируемые компенсаторы, которые ускоряют спад напряжения на электродах, но, если они установлены слишком высокими, усилитель будет звонить, поэтому исследователь всегда пытается «настроить» усилитель как можно ближе к границе неконтролируемых колебаний, В этом случае небольшие изменения условий записи могут вызвать звон. Есть два решения: «вернуть» настройки усилителя в безопасный диапазон или быть начеку для признаков того, что усилитель вот-вот зазвонит.
