Войти
Структура двухцепочечной ДНК, продукта синтеза ДНК, с указанием отдельных нуклеотидных единиц и связей. Синтез ДНК представляет собой естественное или искусственное создание молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). ДНК представляет собой макромолекулу, состоящую из нуклеотидных звеньев, которые связаны ковалентными связями и водородными связями в повторяющейся структуре. Синтез ДНК происходит, когда эти нуклеотидные единицы соединяются вместе с образованием ДНК; это может происходить искусственно (in vitro) или естественным образом (in vivo). Нуклеотидные единицы состоят из азотистого основания (цитозин, гуанин, аденин или тимин), пентозного сахара (дезоксирибоза) и фосфатной группы. Каждая единица соединяется, когда между ее фосфатной группой и пентозным сахаром следующего нуклеотида образуется ковалентная связь, образуя сахарно-фосфатный остов. ДНК представляет собой комплементарную двухцепочечную структуру, поскольку специфическое спаривание оснований (аденин и тимин, гуанин и цитозин) происходит естественным образом, когда между нуклеотидными основаниями образуются водородные связи.
Существует несколько различных определений синтеза ДНК: он может относиться к репликации ДНК - биосинтезу ДНК (амплификация ДНК in vivo), полимеразной цепной реакции - ферментативному синтезу ДНК. (амплификация ДНК in vitro) или синтез гена - физическое создание искусственных последовательностей генов. Хотя каждый тип синтеза очень отличается, у них есть некоторые общие черты. Нуклеотиды, которые были соединены в полинуклеотиды, могут действовать как матрица ДНК для одной из форм синтеза ДНК - ПЦР. Репликация ДНК также работает с использованием шаблона ДНК, двойная спираль ДНК раскручивается во время репликации, подвергая неспаренные основания для новых нуклеотидов водородной связи. Однако для синтеза генов не требуется матрица ДНК, и гены собираются de novo.
Синтез ДНК происходит у всех эукариот и прокариот, а также у некоторых вирусов. Точный синтез ДНК важен, чтобы избежать мутаций ДНК. У людей мутации могут приводить к таким заболеваниям, как рак, поэтому синтез ДНК и механизмы, задействованные in vivo, широко изучались на протяжении десятилетий. В будущем эти исследования могут быть использованы для разработки технологий, включающих синтез ДНК, которые будут использоваться для хранения данных.
Обзор этапов репликации ДНК 
Репликация ДНК и различные участвующие ферменты В природе ДНК Молекулы синтезируются всеми живыми клетками в процессе репликации ДНК. Обычно это происходит при делении клеток. Репликация ДНК происходит так, что во время деления клетки каждая дочерняя клетка содержит точную копию генетического материала клетки. Синтез ДНК in vivo (репликация ДНК) зависит от сложного набора ферментов, которые эволюционировали, чтобы действовать согласованно во время S фазы клеточного цикла. И у эукариот, и у прокариот репликация ДНК происходит, когда специфические топоизомеразы, геликазы и гиразы (белки-инициаторы репликации) раскручивают двухцепочечную ДНК, обнажая азотистые основания. Эти ферменты вместе с дополнительными белками образуют макромолекулярную машину, которая обеспечивает точное дублирование последовательностей ДНК. Происходит комплементарное спаривание оснований с образованием новой двухцепочечной молекулы ДНК. Это известно как полуконсервативная репликация, поскольку одна цепь новой молекулы ДНК происходит от «родительской» цепи.
Эукариотические ферменты постоянно сталкиваются с повреждениями ДНК, которые могут нарушать репликацию ДНК. Это повреждение имеет форму повреждений ДНК, которые возникают спонтанно или из-за агентов, повреждающих ДНК. Поэтому механизмы репликации ДНК строго контролируются, чтобы предотвратить коллапс при повреждении. Контроль системы репликации ДНК гарантирует, что геном реплицируется только один раз за цикл; чрезмерная репликация вызывает повреждение ДНК. Нарушение регуляции репликации ДНК является ключевым фактором нестабильности генома во время развития рака.
Это подчеркивает специфичность механизма синтеза ДНК in vivo. Существуют различные способы искусственного стимулирования репликации естественной ДНК или создания искусственных генных последовательностей. Однако синтез ДНК in vitro может быть очень подвержен ошибкам.
Поврежденная ДНК подлежит репарации с помощью нескольких различных ферментативных процессов репарации, где каждый отдельный процесс специализируется на восстановлении определенных типов повреждений. ДНК человека может быть повреждена из множества естественных источников, и недостаточное восстановление связано с заболеванием и преждевременным старением. Большинство процессов репарации ДНК образуют одноцепочечные разрывы в ДНК на промежуточной стадии репарации, и эти пробелы заполняются репарационным синтезом. Специфические процессы репарации, которые требуют заполнения пробелов путем синтеза ДНК, включают эксцизионную репарацию нуклеотидов, эксцизионную репарацию оснований, репарацию несоответствия, гомологичную рекомбинационную репарацию, негомологичное соединение концов и опосредованное микрогомологией соединение концов.
Обратная транскрипция является частью цикла репликации определенных семейств вирусов, включая ретровирусы. Он включает копирование РНК в двухцепочечную комплементарную ДНК (кДНК) с использованием ферментов обратной транскриптазы. В ретровирусах вирусная РНК вставляется в ядро клетки-хозяина. Там фермент вирусной обратной транскриптазы добавляет нуклеотиды ДНК к последовательности РНК, генерируя кДНК, которая вставляется в геном клетки-хозяина ферментом интегразой, кодирующим вирусные белки.
A полимеразная цепная реакция представляет собой форму ферментативного синтеза ДНК в лаборатории с использованием циклов повторного нагрева и охлаждения реакции плавления ДНК и ферментативной репликации ДНК.
Синтез ДНК во время ПЦР очень похож на синтез живых клеток, но требует очень специфических реагентов и условий. Во время ПЦР ДНК химически извлекается из белков-шаперонов хозяина, затем нагревается, вызывая термическую диссоциацию нитей ДНК. Две новые цепи кДНК построены из исходной цепи, эти цепи можно снова разделить, чтобы они действовали как матрица для других продуктов ПЦР. Исходная ДНК размножается с помощью многих раундов ПЦР. Можно сделать более миллиарда копий исходной цепи ДНК.
Для многих экспериментов, таких как структурные и эволюционные исследования, ученым необходимо создать большую библиотеку вариантов конкретной последовательности ДНК. Случайный мутагенез происходит in vitro, когда мутагенная репликация с использованием ДНК-полимеразы низкой точности сочетается с селективной амплификацией ПЦР для получения множества копий мутантной ДНК.
ОТ-ПЦР отличается от обычная ПЦР, поскольку она синтезирует кДНК из мРНК, а не из матричной ДНК. Этот метод сочетает реакцию обратной транскрипции с амплификацией на основе ПЦР, поскольку последовательность РНК действует как матрица для фермента обратной транскриптазы. ОТ-ПЦР часто используется для проверки экспрессии генов в определенных тканях или типах клеток на различных стадиях развития или для проверки генетических нарушений.
Искусственный синтез генов - это процесс синтеза ген in vitro без необходимости в исходных образцах ДНК-матрицы. В 2010 году Дж. Крейг Вентер и его команда первыми использовали полностью синтезированную ДНК для создания самовоспроизводящегося микроба, получившего название Mycoplasma labratorium.
Синтез олигонуклеотидов - это химический синтез последовательностей нуклеиновые кислоты. Большинство биологических исследований и биоинженерии включает синтетическую ДНК, которая может включать олигонуклеотиды, синтетические гены или даже хромосомы. Сегодня вся синтетическая ДНК создается на заказ с использованием фосфорамидитного метода Марвином Х. Карутерсом. Олиго синтезируются из строительных блоков, которые копируют природные основы. Этот процесс автоматизирован с конца 1970-х годов и может использоваться для формирования желаемых генетических последовательностей, а также для других целей в медицине и молекулярной биологии. Однако создание последовательностей химическим путем нецелесообразно за пределами 200–300 оснований и является экологически опасным процессом. Эти олигонуклеотиды, состоящие примерно из 200 оснований, могут быть связаны методами сборки ДНК, создавая более крупные молекулы ДНК.
В некоторых исследованиях изучалась возможность ферментативного синтеза с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT), ДНК-полимеразы, для которой не требуется матрица. Однако этот метод еще не так эффективен, как химический синтез, и коммерчески недоступен.
С развитием искусственного синтеза ДНК изучается возможность хранения данных ДНК. Благодаря сверхвысокой плотности хранения и долгосрочной стабильности синтетическая ДНК представляет собой интересный вариант для хранения больших объемов данных. Хотя информацию можно очень быстро получить из ДНК с помощью технологий секвенирования нового поколения, синтез ДНК de novo является основным узким местом в этом процессе. За цикл может быть добавлен только один нуклеотид, причем каждый цикл занимает секунды, поэтому общий синтез занимает очень много времени и очень подвержен ошибкам. Однако, если биотехнология улучшится, синтетическая ДНК однажды может быть использована для хранения данных.
Сообщалось, что новые пары азотистых оснований могут быть синтезированы, а также AT (аденин - тимин ) и GC (гуанин - цитозин ). Синтетические нуклеотиды могут использоваться для расширения генетического алфавита и обеспечения специфической модификации участков ДНК. Даже всего одна третья пара оснований увеличила бы количество аминокислот, которые могут быть закодированы ДНК, с существующих 20 аминокислот до возможных 172.. ДНК Хатимоджи состоит из восьми букв нуклеотидов, образуя четыре возможных основания пары. Таким образом, это вдвое больше информационной плотности естественной ДНК. Согласно исследованиям, РНК даже была произведена из ДНК хатимоджи. Эту технологию также можно использовать для хранения данных в ДНК.
