S фаза (фаза синтеза ) - это фаза клеточного цикла, в которой ДНК реплицируется , происходящая между G1фаза и G2фаза. Поскольку точное дублирование генома имеет решающее значение для успешного деления клеток, процессы, происходящие во время S-фазы, строго регулируются и широко сохраняются.
Вход в S-фазу контролируется точкой ограничения G1 (R), которая фиксирует клетки до конца клеточного цикла, если есть адекватные питательные вещества и сигналы роста. Этот переход по существу необратим; после прохождения точки ограничения клетка будет проходить через S-фазу, даже если условия окружающей среды станут неблагоприятными.
Соответственно, переход в S-фазу контролируется молекулярными путями, которые способствуют быстрому однонаправленному изменению состояния клетки. В дрожжах, например, рост клеток вызывает накопление Cln3 циклина, который образует комплекс с циклинзависимой киназой CDK2. Комплекс Cln3-CDK2 способствует транскрипции генов S-фазы путем инактивации репрессора транскрипции Whi5. Поскольку повышающая регуляция генов S-фазы приводит к дальнейшему подавлению Whi5, этот путь создает петлю положительной обратной связи, которая полностью передает клеткам экспрессию гена S-фазы.
Замечательно похожая регуляторная схема существует в клетки млекопитающих. Митогенные сигналы, полученные на протяжении G1-фазы, вызывают постепенное накопление циклина D, который образует комплекс с CDK4 / 6. Активный комплекс циклин D-CDK4 / 6 индуцирует высвобождение фактора транскрипции E2F, который, в свою очередь, инициирует экспрессию генов S-фазы. Несколько генов-мишеней E2F способствуют дальнейшему высвобождению E2F, создавая петлю положительной обратной связи, аналогичную той, которая обнаруживается у дрожжей.
На протяжении фазы M и фазы G1 клетки собираются неактивные комплексы до репликации (pre-RC) на точках репликации, распределенные по всему геному. Во время S-фазы клетка превращает пре-RC в активные репликационные вилки, чтобы инициировать репликацию ДНК. Этот процесс зависит от киназной активности Cdc7 и различных CDK в S-фазе, оба из которых активируются при входе в S-фазу.
Активация пре-RC является строго регулируемой и очень последовательный процесс. После того, как CDK Cdc7 и S-фазы фосфорилируют свои соответствующие субстраты, второй набор репликативных факторов связывается с пре-RC. Стабильная ассоциация побуждает геликазу MCM раскручивать небольшой участок родительской ДНК на две нити оцДНК, которая, в свою очередь, рекрутирует белок репликации А (RPA ), связывающий оцДНК белок. Рекрутирование RPA подготавливает репликационную вилку к загрузке репликативных ДНК полимераз и PCNA скользящих зажимов. Загрузка этих факторов завершает активную вилку репликации и инициирует синтез новой ДНК.
Полная сборка и активация репликационной вилки происходит только на небольшом подмножестве источников репликации. Все эукариоты обладают гораздо большим количеством источников репликации, чем строго необходимо в течение одного цикла репликации ДНК. Избыточные источники могут увеличить гибкость репликации ДНК, позволяя клеткам контролировать скорость синтеза ДНК и реагировать на стресс репликации.
Поскольку новая ДНК должна быть упакована в нуклеосомы для правильного функционирования наряду с репликацией ДНК происходит синтез канонических (невариантных) белков гистонов. Во время ранней S-фазы комплекс циклин E-Cdk2 фосфорилирует NPAT, ядерный коактиватор транскрипции гистонов. NPAT активируется путем фосфорилирования и рекрутирует комплекс ремоделирования хроматина Tip60 на промоторы гистоновых генов. Активность Tip60 удаляет тормозные структуры хроматина и приводит к увеличению скорости транскрипции от трех до десяти раз.
Помимо увеличения транскрипции гистоновых генов, вступление в S-фазу также регулирует продукцию гистонов на уровне РНК. Вместо полиаденилированных хвостов канонические гистоновые транскрипты обладают консервативным мотивом 3` петли стебля, который избирательно связывается с белком, связывающим петлю стволовой петли (SLBP ). Связывание SLBP необходимо для эффективной обработки, экспорта и трансляции мРНК гистонов, что позволяет ему функционировать как высокочувствительный биохимический «переключатель». Во время S-фазы накопление SLBP действует вместе с NPAT, резко увеличивая эффективность продукции гистонов. Однако, как только S-фаза заканчивается, как SLBP, так и связанная РНК быстро разрушаются. Это немедленно останавливает производство гистонов и предотвращает токсическое накопление свободных гистонов.
Свободные гистоны, продуцируемые клеткой во время S- фазы быстро встраиваются в новые нуклеосомы. Этот процесс тесно связан с вилкой репликации, происходящей непосредственно «впереди» и «позади» комплекса репликации. Транслокация геликазы MCM вдоль ведущей цепи разрушает октамеры родительских нуклеосом, что приводит к высвобождению субъединиц H3-H4 и H2A-H2B. Повторная сборка нуклеосом позади репликационной вилки опосредуется факторами сборки хроматина (CAF), которые слабо связаны с белками репликации. Хотя это не совсем понятно, повторная сборка, по-видимому, не использует полуконсервативную схему, наблюдаемую при репликации ДНК. Эксперименты по маркировке показывают, что дупликация нуклеосом является преимущественно консервативной. Отцовская коровая нуклеосома H3-H4 остается полностью отделенной от вновь синтезированных H3-H4, что приводит к образованию нуклеосом, которые содержат либо исключительно старые H3-H4, либо исключительно новые H3-H4. «Старые» и «новые» гистоны назначаются каждой дочерней цепи полуслучайно, что приводит к равному разделению регуляторных модификаций.
Сразу после деления только каждая дочерняя хроматида обладает половиной эпигенетических модификаций, присутствующих в отцовской хроматиде. Клетка должна использовать этот частичный набор инструкций для восстановления функциональных доменов хроматина перед входом в митоз.
Для больших участков генома наследование старых нуклеосом H3-H4 достаточно для точного восстановления доменов хроматина. Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2 ) и несколько других модифицирующих гистоны комплексов могут «копировать» модификации, присутствующие на старых гистонах, на новые гистоны. Этот процесс усиливает эпигенетические метки и противодействует разбавляющему эффекту дупликации нуклеосом.
Однако для небольших доменов, приближающихся к размеру отдельных генов, старые нуклеосомы распределены слишком тонко для точного распространения модификаций гистонов. В этих регионах структура хроматина, вероятно, контролируется включением вариантов гистонов во время повторной сборки нуклеосом. Тесная корреляция, наблюдаемая между H3.3 / H2A.Z и транскрипционно активными областями, подтверждает этот предполагаемый механизм. К сожалению, причинно-следственная связь еще не доказана.
Во время S-фазы клетка непрерывно исследует свой геном на предмет аномалий. Обнаружение повреждения ДНК вызывает активацию трех канонических «путей контрольной точки» S-фазы, которые задерживают или останавливают дальнейшее развитие клеточного цикла:
В дополнение к этим каноническим контрольным точкам, недавние данные свидетельствуют о том, что нарушения в доставке гистонов и сборке нуклеосом может также изменить прогрессирование S-фазы. Истощение свободных гистонов в клетках дрозофилы резко удлиняет S-фазу и вызывает постоянную остановку в G2-фазе. Этот уникальный фенотип ареста не связан с активацией канонических путей повреждения ДНК, что указывает на то, что сборку нуклеосом и поставку гистонов можно тщательно исследовать с помощью новой контрольной точки S-фазы.