Войти
Тропомиозин представляет собой двухцепочечную альфа-спиральную спиральную спираль белок, обнаруженный в цитоскелете клеток.
Все организмы содержат органеллы, обеспечивающие физическое целостность своих клеток. Органеллы этого типа в совокупности известны как цитоскелет, и одна из самых древних систем основана на нитевидных полимерах белка актина. Полимер второго белка, тропомиозина, является неотъемлемой частью большинства актиновых филаментов у животных.
Тропомиозины представляют собой большое семейство интегральных компонентов актиновых филаментов, которые играют решающую роль в регулировании функции актиновых филаментов как в мышечных, так и в немышечных клетках. Эти белки состоят из палочкообразных спиралевидных гетеро- или гомо- димеров, которые лежат вдоль α-спиральной бороздки большинства актиновых филаментов. Взаимодействие происходит по длине актинового филамента, при этом димеры выравниваются по типу голова к хвосту.
Тропомиозины часто подразделяются на две группы: мышечные тропомиозины изоформы и немышечные изоформы тропомиозина. Изоформы мышечного тропомиозина участвуют в регуляции взаимодействий между актином и миозином в мышцах саркомере и играют ключевую роль в регулируемом сокращении мышц. Немышечные изоформы тропомиозина функционируют во всех клетках, как мышечных, так и немышечных, и участвуют в ряде клеточных путей, которые контролируют и регулируют цитоскелет клетки и другие ключевые клеточные функции.
Система актиновых нитей, которая участвует в регуляции этих клеточных путей, более сложна, чем системы актиновых нитей, регулирующих сокращение мышц. Сократительная система опирается на 4 изоформы актиновых нитей и 5 изоформ тропомиозина, тогда как система актиновых нитей цитоскелета использует две изоформы актиновых нитей и более 40 изоформ тропомиозина.
Непосредственно контраст правила «один ген, один полипептид » мы теперь знаем из комбинации геномного секвенирования, такой как Human Genome Project и EST данные экспрессированных белков о том, что многие эукариоты продуцируют ряд белков из одного гена. Это играет решающую роль в функциональности высших эукариот, поскольку люди экспрессируют более чем в 5 раз больше различных белков (изоформ) посредством альтернативного сплайсинга, чем у них есть гены. С механистической точки зрения, организму намного легче расширить существующее семейство генов / белков (создавая изоформы белков), чем создать совершенно новый ген. С эволюционной точки зрения тропомиозины у высших эукариот примечательны тем, что сохраняют все 4 потенциальных гена, продуцируемых в результате двойной геномной дупликации, имевшей место на ранней стадии эволюции эукариот.
У млекопитающих четыре гена ответственны за создание более 40 различных изоформ тропомиозина. С точки зрения структуры гены очень похожи, что позволяет предположить, что они возникли в результате дупликации гена предка. У людей эти гены больше не связаны и широко рассредоточены. У людей α-, β-, γ- и δ-гены формально известны как TPM1, TPM2, TPM3 и TPM4. и расположены в 15q22, 9p13, 1q22 и 19p13 соответственно.
Изоформы определяются как тесно связанные генные продукты, которые, по сути, выполняют схожие биологические функции, с вариациями, существующими между изоформами с точки зрения биологической активности, регуляторных свойств, временной и пространственной экспрессии и / или межклеточного расположения.. Изоформы продуцируются двумя различными механизмами: дупликацией генов и альтернативным сплайсингом. Первый механизм - это процесс, при котором несколько копий гена генерируются посредством неравного кроссинговера, тандемной дупликации или транслокации. Альтернативный сплайсинг - это механизм, при котором экзоны либо сохраняются в мРНК, либо нацелены на удаление в различных комбинациях для создания разнообразного массива мРНК из одной пре-мРНК.
Огромный массив изоформ тропомиозина генерируется с использованием комбинации различных генов и альтернативного сплайсинга. У млекопитающих, независимо от гена, транскрипция инициируется в начале либо экзона 1a, либо экзона 1b. В зависимости от того, какой промотор и начальный экзон были использованы, изоформы тропомиозина можно разделить на категории с высокой молекулярной массой (HMW, 284 аминокислоты) или низкомолекулярными (LMW, 248). Изоформы HMW экспрессируют экзон 1a и либо 2a, либо 2b, тогда как изоформы LMW экспрессируют экзон 1b. На сегодняшний день все известные тропомиозины содержат экзоны 3-9. Альтернативный сплайсинг может происходить в экзоне 6 с взаимоисключающим выбором экзона 6a или 6b. На c-конце транскрипт снова сплайсирован в экзоне 9 с выбором экзона 9a, 9b, 9c или 9d.
С точки зрения структуры, гены очень похожи, что позволяет предположить, что они возникли в результате дупликации наследственного гена. Наиболее родственными генами являются α- и γ-гены, использующие два промотора и различающиеся только наличием уникального экзона 2a в α-гене. Хотя при сравнении последовательностей были выявлены существенные различия между альтернативными экзонами одного и того же гена (1a и 1b, 6a и 6b, а также экзон 9s), большинство экзонов, тем не менее, высоко консервативны между разными генами. Например, экзоны 1a и 1b из α-гена значительно различаются по последовательности; однако последовательность экзона 1a из α-, β-, γ- и δ-генов высококонсервативна.
Из-за консервативного характера генов считается, что гены произошли от общего предкового гена, дав начало более 40 функционально различным изоформ. Экспрессия этих изоформ строго регулируется и варьируется на протяжении всего развития. Разнообразие экспрессии тропомиозина как в пространстве, так и во времени дает возможность не только регулировать функцию актиновых филаментов, но и создавать специализированные популяции актиновых филаментов.
Многочисленные отчеты Детально, что изоформы тропомиозина отсортированы по разным внутриклеточным местоположениям, часто ассоциируясь с популяциями актиновых филаментов, которые участвуют в определенных процессах. Прямая визуализация пространственной сегрегации изоформ первоначально наблюдалась Бургойном и Норманом, а вскоре после этого Лин и соавторами. Они заметили, что определенные изоформы были связаны с различными клеточными структурами. Используя специфические антитела, они смогли идентифицировать присутствие как HMW, так и LMW изоформ γ-гена в стрессовых волокнах; однако только изоформы LMW были обнаружены в рыхлых мембранах.
. Эти исследования были расширены на ряд типов клеток с аналогичными результатами. Обширные исследования нейрональных клеток, фибробластов, скелетных мышц и остеокластов дополнительно подчеркнули сложную ассоциацию изоформ тропомиозина с клеточными структурами. Эти исследования привели к пониманию того, что регулирование сортировки изоформ является чрезвычайно сложным и строго регулируемым.
Сортировка изоформ тропомиозина в дискретных внутриклеточных местоположениях регулируется в процессе развития. Первоначальные исследования показали, что сортировка изоформ изменялась в процессе развития, причем тропомиозин 4 изначально был локализован в конусе роста растущих нейронов, но в зрелых нейронах он был перемещен в соматодендритный компартмент. Эти наблюдения были подтверждены исследованиями различных изоформ тропомиозина, показывающими, как популяции тропомиозина перемещались во время созревания нейронов. Эти данные подтверждают мнение о том, что изоформы тропомиозина подвержены временной регуляции.
Дополнительные исследования выявили роль клеточного цикла в сортировке изоформ. Исследование, в ходе которого проводился скрининг ряда продуктов HMW из α- и β-генов и сравнивалась локализация с продуктами LMW из γ-гена, было обнаружено, что продукты HMW и LMW взаимно исключают друг друга во время ранней фазы G1 клеточный цикл.
PDB: 1C1G Цепь тропомиозина A, B, C, D Хотя исследования показывают, что сортировка мРНК может влиять на сортировку тропомиозина, нет абсолютной корреляции между мРНК и местоположением белка. В нейронах было обнаружено, что мРНК тропомиозина 5NM1 сортируется на полюс нейрона, вырабатывающего аксон до морфологической дифференцировки. Сортировка мРНК тропомиозина 5NM1 / 2 в это место коррелировала с экспрессией белка тропомиозина 5NM1 / 2. Напротив, мРНК, кодирующая белок Tropomyosin Br2, была исключена из полюса нейрона.
Связь между сортировкой мРНК и локализацией белка была протестирована на моделях трансгенных мышей. Модели были созданы таким образом, чтобы кодирующие области тропомиозина 5NM1 / 2 и тропомиозина 3 экспрессировались под контролем промотора β-актина с нетранслируемой областью β-актина, лишенной информации о нацеливании. Исследование показало, что тропомиозин 3, изоформа, которая обычно не экспрессируется в нейрональных клетках, широко распределяется по нейрону, в то время как экзогенная экспрессия нейрональной изоформы тропомиозина 5NM1 / 2 сортируется по конусу роста нейронов, как и эндогенная Тропомиозин 5НМ1 / 2. Поскольку эти два трансгена различаются только в кодирующей области тропомиозина, но локализованы в двух разных областях, полученные данные свидетельствуют о том, что помимо сортировки мРНК сами белки содержат информацию для сортировки.
Исследования показывают, что на сортировку изоформ тропомиозина также может влиять состав изоформ актина микрофиламентов. В миобластах избыточная экспрессия γ-актина приводит к подавлению β-актина и удалению тропомиозина 2, но не тропомиозина 5 из стрессовых волокон. Позже было обнаружено, что, когда клетки подвергались воздействию цитохалазина D, химического вещества, которое приводит к дезорганизации актиновых филаментов, сортировка изоформ тропомиозина была нарушена. После вымывания цитохалазина D сортировка изоформ тропомиозина была восстановлена. Это указывает на сильную взаимосвязь между процессом сортировки изоформ тропомиозина и включением изоформ тропомиозина в организованные массивы актиновых филаментов. Нет никаких доказательств активного транспорта изоформ тропомиозина в определенные места. Скорее, похоже, что сортировка является результатом локальной сборки предпочтительных изоформ в конкретном внутриклеточном сайте. Механизмы, лежащие в основе сортировки изоформ тропомиозина, по-видимому, по своей природе гибкие и динамичные по своей природе.
Многие исследования привели к пониманию того, что тропомиозины выполняют важные функции и необходимы для самых разных видов, от дрожжей, червей и мух до сложных млекопитающих.
Существенная роль тропомиозинов была обнаружена в лаборатории Бретчера, где исследователи обнаружили, что за счет устранения гена TPM1 почкующихся дрожжей скорость роста была снижена, присутствие актиновых кабелей исчезло, наблюдались дефекты везикулярного транспорта., и спаривание дрожжей было плохим. Когда второй дрожжевой ген, TPM2, был удален, никаких наблюдаемых изменений фенотипа зарегистрировано не было; однако при удалении вместе с TPM1 это привело к летальному исходу. Это предполагает, что гены TPM1 и -2 выполняют перекрывающуюся функцию; однако TPM2 не может полностью компенсировать потерю TPM1, что указывает на то, что некоторые функции TPM1 уникальны. Подобные результаты наблюдались у мух, червей, амфибий и млекопитающих, подтверждая предыдущие результаты и предполагая участие тропомиозина в широком спектре клеточных функций. Однако три коэкспрессируемых гена TMP1, 2 и 4 не могут компенсировать делецию гена TPM3 в эмбриональных стволовых клетках и доимплантационных эмбрионах мыши.
Результаты экспериментов с нокаутом генов могут быть неоднозначными и должны быть тщательно изучены. В исследованиях, в которых делеция гена приводит к летальному исходу, сначала может показаться, что продукт гена играет действительно уникальную роль. Однако летальность также может быть результатом неспособности скомпрометированной клетки экспрессировать другие изоформы для восстановления фенотипа, поскольку требуемая изоформа не экспрессируется в клетке естественным образом.
Система актиновых микрофиламентов является фундаментальной системой цитоскелета, участвующей в развитии и поддержании морфологии клеток. Способность этой системы легко реагировать на клеточные сигналы и подвергаться структурной реорганизации привела к убеждению, что эта система регулирует определенные структурные изменения в различных клеточных регионах.
В организме человека существует только шесть изоформ актина, и эти изоформы отвечают за множество уникальных и сложных клеточных структур и ключевых клеточных взаимодействий. Считается, что функция и форма актинового цитоскелета в значительной степени контролируются актин-связывающими белками (ABP), которые связаны с полимером актина. ABP - это группа белков, которые связываются с актином. Хотя тропомиозин иногда включается как АД, это не истинное АД. Димер тропомиозина имеет очень низкое сродство к актиновой нити и не образует ван-дер-ваальсовых контактов с актином. Только образование намотки полимера тропомиозина вокруг актиновой нити обеспечивает стабильность взаимодействия тропомиозин-актиновая нить.
Многие исследования показывают, что связывание изоформ тропомиозина с актиновым филаментом может влиять на связывание других ABP, которые вместе изменяют структуру и передают специфические свойства и, в конечном счете, специфические функции актиновому филаменту. Это продемонстрировано на нейроэпителиальных клетках, где повышенная экспрессия тропомиозина 5NM1 увеличивает рекрутирование миозина IIB, моторного белка миозина, в область конуса роста. Однако сверхэкспрессия тропомиозина Br3 имела противоположный эффект, снижая активность миозина в той же области.
В новаторском исследовании Бернштейна и Бамбурга было обнаружено, что фактор деполимеризации актина актин-связывающего белка (ADF) / кофилин, фактор, который способствует деполимеризации актиновых волокон, конкурирует с тропомиозином. для связывания с актиновым филаментом. Экспрессия тропомиозина 5NM1 в нейрональных клетках устраняет ADF / кофилин из области конуса роста, что приводит к более стабильным актиновым филаментам. Однако наблюдали повышенную экспрессию Tropomyosin Br3 для рекрутирования ADF / cofilin на актиновые филаменты, связанные с изоформой Tropomyosin Br3 в ламеллиподии, что привело к разборке актиновых филаментов. Этот феномен, посредством которого специфическая изоформа тропомиозина направляет специфические взаимодействия между актин-связывающими белками, и актиновые филаменты наблюдались во множестве модельных систем с рядом различных связывающих белков (rev. Gunning et al., 2008). Эти взаимодействия под влиянием изоформ тропомиозина позволяют актиновым филаментам участвовать в разнообразном диапазоне клеточных функций.
Скелетная мышца состоит из крупных, многоядерных клеток (мышечных волокон ). Каждое мышечное волокно заполнено продольными массивами миофибрилл. Миофибриллы состоят из повторяющихся белковых структур или саркомеров, основной функциональной единицы скелетных мышц. Саркомер - это высокоструктурированный протеиновый массив, состоящий из пересекающихся толстых и тонких нитей, где тонкие нити привязаны к структуре протеина, Z-линии. Динамическое взаимодействие между толстыми и тонкими нитями приводит к сокращению мышц.
Миозин принадлежит к семейству моторных белков, и мышечные изоформы этого семейства составляют толстые нити. Тонкая нить состоит из изоформ актина скелетных мышц. Каждый миозиновый белок «движется» по тонкой актиновой нити, неоднократно связываясь с миозин-связывающими участками вдоль актиновой нити, сдвигаясь и отпуская. Фактически, толстая нить движется или скользит по тонкой нити, что приводит к сокращению мышц. Этот процесс известен как модель скользящего филамента.
. Связывание миозиновых головок с мышечным актином является строго регулируемым процессом. Тонкая нить состоит из актина, тропомиозина и тропонина. Сокращение скелетных мышц вызывается нервными импульсами, которые, в свою очередь, стимулируют высвобождение Са. Высвобождение Са из саркоплазматического ретикулума вызывает увеличение концентрации Са в цитозоле. Затем ионы кальция связываются с тропонином, который связан с тропомиозином. Связывание вызывает изменения в форме тропонина и впоследствии заставляет изоформу тропомиозина сдвигать свое положение на актиновой нити. Это смещение позиции обнажает миозин-связывающие сайты на актиновой нити, позволяя миозиновым головкам толстой нити связываться с тонкой нитью.
Структурные и биохимические исследования показывают, что положение тропомиозина и тропонина на тонкой нити регулирует взаимодействия между миозиновыми головками толстой нити и сайтами связывания на актине тонкой нити. Дифракция рентгеновских лучей и криоэлектронная микроскопия предполагают, что тропомиозин стерически блокирует доступ миозина к актиновой нити.
Хотя эта модель хорошо известна, неясно, вызывает ли движение тропомиозина прямое взаимодействие головки миозина с актиновой нитью. Таким образом, появилась альтернативная модель, согласно которой движение тропомиозина в филаменте действует как аллостерический переключатель , который модулируется путем активации связывания миозина, но не функционирует исключительно за счет регулирования связывания миозина.
Гладкая мышца - это тип неполосатых мышц, и, в отличие от поперечно-полосатых мышц, сокращение гладких мышц не контролируется сознанием. Гладкая мускулатура может сокращаться спонтанно или ритмично и вызываться рядом физико-химических агентов (гормоны, лекарства, нейротрансмиттеры). Гладкая мускулатура находится в стенках различных органов и трубок тела, таких как пищевод, желудок, кишечник, бронхи, уретра, мочевой пузырь и кровеносные сосуды.
Хотя гладкие мышцы не образуют регулярных массивов толстых и тонких нитей, таких как саркомеры поперечно-полосатых мышц, сокращение все же происходит из-за того же механизма скольжения нитей, контролируемого поперечными мостиками миозина, взаимодействующими с актиновыми нитями. Тонкая нить гладкой мускулатуры состоит из актина, тропомиозина, кальдесмона и кальмодулина. В этом типе мышц кальдесмон и кальмодулин контролируют опосредованный тропомиозином переход между включенным и выключенным состояниями активности. Кальдесмон связывается с актином, тропомиозином, кальмодулином и миозином, из которых наиболее важны его взаимодействия с актином. На связывание кальдесмона сильно влияет тропомиозин. Кальдесмон является ингибитором актиномиозиновой АТФазы и подвижности, и как связывание актина, так и ингибирование кальдесмона значительно усиливаются в присутствии тропомиозина.
Сокращение гладких мышц инициируется высвобождением Ca. Са связывается и активирует кальмодулин, который затем связывается с кальдесмоном. Это связывание заставляет белок кальдесмона отделяться от актинового филамента, обнажая миозин-связывающие участки на актиновом филаменте. Моторные головки миозина фосфорилируются киназой легкой цепи миозина, позволяя миозиновой головке взаимодействовать с актиновым филаментом и вызывать сокращение.
Цитоскелет представляет собой сложную сеть нитей, необходимых для правильного функционирования ряда клеточных процессов, включая подвижность клеток, деление клеток, внутриклеточную транспортировку и поддержание клеток. форма. Цитоскелет состоит из трех различных систем филаментов: микротрубочек, промежуточных филаментов и микрофиламентов (также известных как актиновый цитоскелет). Именно динамические взаимодействия между этими филаментами наделяют клетки уникальными структурами и функциями.
Ряд регуляторных механизмов, использующих многие актин-связывающие белки, эволюционировал для управления динамикой системы актиновых филаментов. Считается, что тропомиозины играют ключевую роль в этой регуляторной системе, влияя на ассоциации актинового филамента с другими ABP. Вместе эти ассоциации наделяют филамент специфическими свойствами, позволяя этим структурам участвовать в широком спектре клеточных процессов, а также быстро реагировать на клеточные стимулы.
Многие исследования показали, что существуют специфические изменения в репертуаре тропомиозинов, экспрессируемых в клетках, которые подвергаются клеточной трансформации. Эти хорошо воспроизводимые результаты предполагают, что во время процесса клеточной трансформации, процесса, при котором нормальная клетка становится злокачественной, происходит снижение синтеза изоформ HMW тропомиозина. В первоначальных исследованиях трансформация линии клеток фибробластов эмбриона крысы REF-52 и нормальных клеток почек крысы приводила к снижению синтеза тропомиозинов HMW. В обеих этих системах подавление регуляции способствовало снижению уровней мРНК. Эти ранние результаты показали, что тропомиозины играют критическую роль в облегчении определенных процессов, которые происходят во время трансформации клеток, таких как реорганизация актиновых филаментов и изменения формы клеток. Эти исследования были воспроизведены в других лабораториях и на других клеточных линиях с аналогичными результатами (обзор в Gunning et al., 2008).
Кроме того, исследования выявили связь между экспрессией изоформы тропомиозина и приобретением метастатических свойств. В исследовании сравнивалась экспрессия изоформ между клеточной линией карциномы легких Льюиса с низким и высоким уровнем метастазов. Исследование показало, что по мере того, как клетки становятся более метастатическими, наблюдается заметное снижение экспрессии белка тропомиозина 2 HMW и уровней мРНК.
Эти результаты были подтверждены на первичных опухолях и на моделях человека. Исследования рака толстой кишки и мочевого пузыря показали повышенную экспрессию низкомолекулярного тропомиозина Тропомиозина 5NM1. Повышенная экспрессия этой изоформы также наблюдалась в трансформированных фибробластах крыс, и считается, что эта изоформа необходима для подвижности высокометастатической меланомы. Кроме того, повышенная экспрессия тропомиозина 4 связана с метастазированием в лимфатические узлы при раке груди.
Все эти исследования предполагают, что изменения в экспрессии и составе изоформ тропомиозина являются неотъемлемой частью рака и его прогрессирования. Консенсус состоит в том, что в целом раковые клетки становятся более зависимыми от низкомолекулярных тропомиозинов, поскольку высокочастотные тропомиозины исчезают с увеличением злокачественности. Это открытие привело к разработке новых соединений антитропомиозина в качестве потенциальных противораковых агентов.
Тропомиозины вовлечены в аутоиммунное заболевание язвенный колит, заболевание толстой кишки, которое характеризуется язвами или открытыми язвами. Связь между этим заболеванием и тропомиозином была впервые подтверждена в исследовании, которое обнаружило, что сыворотка крови, взятая у 95% пациентов с язвенным колитом, содержала антитела, которые положительно реагировали на тропомиозин. Дополнительные исследования подтвердили эти результаты, но также идентифицируют тропомиозин 5 и тропомиозин 1 как основные тропомиозины, участвующие в патогенезе язвенного колита. Тропомиозин 5 был связан с развитием поучита в подвздошной кишке после операции по поводу язвенного колита. Повышенное количество IgG-продуцирующих клеток в слизистой оболочке толстой кишки пациентов с язвенным колитом в значительной степени способствует продуцированию IgG против эпитопов, связанных с тропомиозином 5. Следовательно, тропомиозин 5 способен вызывать значительный Т-клеточный ответ. Физико-химический анализ общих структурных мотивов, присутствующих в 109 аутоантигенах человека, показал, что тропомиозины имеют наибольшее количество таких мотивов и, следовательно, очень высокую склонность действовать как аутоантигены.
В дополнение к той роли, которую тропомиозины играют в язвенном колите., антитела к тропомиозину также описаны при острой ревматической лихорадке и воспалительном заболевании синдроме Бехчета. В обоих случаях неясно, играют ли эти антитела прямую роль в патогенезе этих состояний человека или отражают высокую антигенность тропомиозинов, высвобождаемых из поврежденных клеток.
Немалиновая миопатия - это мышечное заболевание, которое характеризуется наличием электронно-плотных стержневых тел в волокнах скелетных мышц. Эти электронно-плотные стержневые тела состоят в основном из α-актинина и актина. Расстройство часто клинически классифицируется на несколько групп, включая легкие (типичные), промежуточные, тяжелые и взрослые; однако эти различия несколько неоднозначны, поскольку категории часто пересекаются. Причинные мутации были обнаружены в скелетном α-актинине, тропомиозине, небулине и тропонине. У людей были идентифицированы мутации как в генах γ-тропомиозина, так и в генах β-тропомиозина. Никаких мутаций в гене α-тропомиозина в этом состоянии у людей не выявлено.
«Моллюски» включают ракообразных и моллюсков. Тропомиозин является белком, который в первую очередь отвечает за аллергию на моллюсков.
В научном сообществе существует большой интерес к изоформам тропомиозина и Учитывая огромное количество процессов, в которых, как сообщается, участвует этот белок, это неудивительно.
Одним из способов детального изучения этого белка и, что более важно, конкретных изоформ, является использование антител. Эти специфические антитела можно использовать в экспериментах по белковому блоттингу и наносить на клетки или срезы тканей и наблюдать под микроскопом. Это позволяет исследователям не только определять уровень или концентрацию изоформы или группы изоформ, но также определять клеточное местоположение конкретной изоформы и ассоциации с другими клеточными структурами или белками.
В настоящее время имеется много коммерчески доступных антител; однако многие из этих антител продаются с минимальной информацией относительно антигена, используемого для повышения уровня антител, и, следовательно, специфичности изоформы, поскольку некоторые исследовательские группы разрабатывают свои собственные антитела. Прежде чем эти антитела можно будет использовать, их необходимо тщательно охарактеризовать, в ходе которого исследуется специфичность антитела, чтобы гарантировать, что антитело не вступает в перекрестную реакцию с другими тропомиозинами или другими белками.
