Метаболическая инженерия

редактировать
Некоторые этапы разработки метаболического процесса

Метаболическая инженерия - это практика оптимизации генетических и регуляторных процессов в клетках с целью увеличения производства клетками определенного вещества. Эти процессы представляют собой химические сети, которые используют серию биохимических реакций и ферментов, которые позволяют клеткам преобразовывать сырье в молекулы, необходимые для выживания клетки. Метаболическая инженерия, в частности, стремится математически смоделировать эти сети, рассчитать выход полезных продуктов и точно определить части сети, которые ограничивают производство этих продуктов. Затем можно использовать методы генной инженерии для модификации сети, чтобы снять эти ограничения. И снова эта модифицированная сеть может быть смоделирована для расчета выхода нового продукта.

Конечная цель метаболической инженерии - иметь возможность использовать эти организмы для получения ценных веществ в промышленных масштабах экономически эффективным способом. Текущие примеры включают производство пива, вина, сыра, фармацевтических препаратов и других биотехнологических продуктов. Некоторые из общих стратегий, используемых для метаболической инженерии, включают (1) сверхэкспрессию гена, кодирующего ограничивающий скорость фермент пути биосинтеза, (2) блокирование конкурирующих метаболических путей, (3) экспрессию гетерологичных генов и (4) ферментную инженерию.

Поскольку клетки используют эти метаболические сети для своего выживания, изменения могут сильно повлиять на жизнеспособность клеток. Следовательно, в метаболической инженерии возникает компромисс между способностью клеток производить желаемое вещество и их естественными потребностями в выживании. Следовательно, вместо прямого удаления и / или сверхэкспрессии генов, кодирующих метаболические ферменты, в настоящее время основное внимание уделяется нацеливанию на регуляторные сети в клетке, чтобы эффективно спроектировать метаболизм.

Содержание
  • 1 История и приложения
  • 2 Анализ метаболического потока
    • 2.1 Настройка метаболического пути для анализа
    • 2.2 Анализ метаболического пути
    • 2.3 Определение оптимальных генетических манипуляций
    • 2.4 Экспериментальные измерения
  • 3 См. Также
  • 4 ссылки
  • 5 Внешние ссылки
История и приложения
Клеточный метаболизм можно оптимизировать для промышленного использования.

В прошлом, чтобы увеличить продуктивность желаемого метаболита, микроорганизм был генетически модифицирован путем химически индуцированной мутации, и затем был выбран мутантный штамм, который сверхэкспрессировал желаемый метаболит. Однако одна из основных проблем этого метода заключалась в том, что метаболический путь производства этого метаболита не был проанализирован, и в результате были неизвестны ограничения на производство и соответствующие ферменты пути, которые должны были быть изменены.

В 1990-х годах появилась новая техника, называемая метаболической инженерией. Этот метод анализирует метаболический путь микроорганизма и определяет ограничения и их влияние на производство желаемых соединений. Затем он использует генную инженерию для снятия этих ограничений. Вот некоторые примеры успешной метаболической инженерии: (i) Выявление ограничений для производства лизина в Corynebacterium glutamicum и внедрение новых генов для снятия этих ограничений с целью улучшения производства (ii) Разработка нового пути биосинтеза жирных кислот, называемого обратным бета-окислением. путь, который более эффективен, чем естественный путь производства жирных кислот и спиртов, которые потенциально могут быть каталитически преобразованы в химические вещества и топливо; (iii) Улучшенное производство DAHP, ароматического метаболита, продуцируемого E. coli, который является промежуточным продуктом в производстве ароматических аминокислоты. С помощью анализа метаболического потока было определено, что теоретический максимальный выход DAHP на используемую молекулу глюкозы составлял 3/7. Это связано с тем, что часть углерода из глюкозы теряется в виде диоксида углерода вместо того, чтобы использоваться для производства DAHP. Кроме того, один из метаболитов (PEP или фосфоенолпируват ), которые используются для производства DAHP, преобразовывался в пируват (PYR) для транспортировки глюкозы в клетку и, следовательно, больше не был доступен для производства DAHP. Чтобы уменьшить нехватку PEP и повысить урожайность, Patnaik et al. использовали генную инженерию на E. coli, чтобы ввести реакцию, которая превращает PYR обратно в PEP. Таким образом, PEP, используемый для транспортировки глюкозы в клетку, регенерируется и может использоваться для производства DAHP. Это привело к новому теоретическому максимальному выходу 6/7 - вдвое больше, чем у нативной системы E. coli.

В промышленных масштабах метаболическая инженерия становится более удобной и рентабельной. По данным Организации биотехнологической промышленности, « в Северной Америке строится более 50 объектов биопереработки, чтобы применить метаболическую инженерию для производства биотоплива и химикатов из возобновляемой биомассы, которые могут помочь сократить выбросы парниковых газов». Потенциальные виды биотоплива включают короткоцепочечные спирты и алканы (для замены бензина ), метиловые эфиры жирных кислот и жирные спирты (для замены дизельного топлива ) и биотопливо на основе жирных кислот и изопреноидов (для замены дизельного топлива ).

Метаболическая инженерия продолжает развиваться с точки зрения эффективности и процессов, чему способствуют прорывы в области синтетической биологии и прогресс в понимании повреждения метаболитов и их восстановления или упреждения. Ранние эксперименты по метаболической инженерии показали, что накопление реактивных промежуточных продуктов может ограничивать поток в сконструированных путях и быть вредным для клеток-хозяев, если соответствующие системы контроля повреждений отсутствуют или неадекватны. Исследователи синтетической биологии оптимизируют генетические пути, которые, в свою очередь, влияют на метаболизм клеток. Недавнее снижение стоимости синтезированной ДНК и развитие генетических схем помогают повлиять на способность метаболической инженерии производить желаемые результаты.

Анализ метаболического потока

Анализ метаболического потока можно найти в разделе Анализ баланса потоков.

Настройка метаболического пути для анализа

Первым шагом в этом процессе является определение желаемой цели, которую необходимо достичь путем улучшения или модификации метаболизма организма. Справочники и онлайн-базы данных используются для исследования реакций и метаболических путей, которые могут привести к появлению этого продукта или результата. Эти базы данных содержат обширную геномную и химическую информацию, включая пути метаболизма и другие клеточные процессы. С помощью этого исследования выбирается организм, который будет использоваться для создания желаемого продукта или результата. При принятии этого решения учитываются следующие соображения: насколько близок метаболический путь организма к желаемому пути, затраты на обслуживание, связанные с организмом, и насколько легко изменить путь организма. Escherichia coli ( E. coli ) широко используется в метаболической инженерии для синтеза широкого спектра продуктов, таких как аминокислоты, поскольку ее относительно легко поддерживать и модифицировать. Если организм не содержит полного пути получения желаемого продукта или результата, тогда в организм должны быть включены гены, которые производят недостающие ферменты.

Анализ метаболического пути

Завершенный метаболический путь моделируется математически, чтобы определить теоретический выход продукта или потоки реакции в клетке. Поток - это скорость, с которой происходит данная реакция в сети. Простой анализ метаболических путей может быть выполнен вручную, но большинство из них требует использования программного обеспечения для выполнения вычислений. Эти программы используют сложные алгоритмы линейной алгебры для решения этих моделей. Чтобы решить сеть с использованием уравнения для определенных систем, показанного ниже, необходимо ввести необходимую информацию о соответствующих реакциях и их потоках. Информация о реакции (такая как реагенты и стехиометрия) содержится в матрицах G x и G m. Матрицы V m и V x содержат потоки соответствующих реакций. После решения уравнение дает значения всех неизвестных потоков (содержащихся в V x ).

V Икс знак равно - ( грамм Икс ) - 1 * ( грамм м * V м ) {\ displaystyle V_ {x} = - (G_ {x}) ^ {- 1} * (G_ {m} * V_ {m})}

Определение оптимальных генетических манипуляций

После определения потоков реакций в сети необходимо определить, какие реакции могут быть изменены, чтобы максимизировать выход желаемого продукта. Чтобы определить, какие именно генетические манипуляции выполнять, необходимо использовать вычислительные алгоритмы, такие как OptGene или OptFlux. Они дают рекомендации относительно того, какие гены следует сверхэкспрессировать, нокаутировать или ввести в клетку, чтобы увеличить производство желаемого продукта. Например, если данная реакция имеет особенно низкий поток и ограничивает количество продукта, программное обеспечение может рекомендовать сверхэкспрессию фермента, катализирующего эту реакцию, в клетке, чтобы увеличить поток реакции. Необходимые генетические манипуляции могут быть выполнены с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Гены могут быть сверхэкспрессированы или выбиты из организма, в зависимости от их влияния на путь и конечную цель.

Экспериментальные измерения

Чтобы создать решаемую модель, часто необходимо иметь определенные потоки, уже известные или измеренные экспериментально. Кроме того, чтобы проверить влияние генетических манипуляций на метаболическую сеть (чтобы убедиться, что они совпадают с моделью), необходимо экспериментально измерить потоки в сети. Чтобы измерить потоки реакции, измерения потока углерода производятся с использованием изотопной маркировки углерода-13. Организм питается смесью, которая содержит молекулы, в которых атомы углерода сконструированы так, чтобы состоять из атомов углерода-13, а не углерода-12. После того, как эти молекулы используются в сети, последующие метаболиты также становятся меченными углеродом-13, поскольку они включают эти атомы в свои структуры. Специфический паттерн маркировки различных метаболитов определяется реакционными потоками в сети. Образцы маркировки могут быть измерены с использованием таких методов, как газовая хроматография-масс-спектрометрия (ГХ-МС), наряду с вычислительными алгоритмами для определения потоков реакции.

Смотрите также
Рекомендации
  1. ^ Ян, YT, Беннеты, GN, Сан, KY, (1998) Генетические и метаболическая инженерия, Электронный журнал биотехнология, ISSN   0717-3458
  2. ^ Н. Милн, П. Томсен, Н. Мёльгаард Кнудсен, П. Рубашка, М. Кристенсен, Л. Бородина (2020-07-01). «Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для производства de novo псилоцибина и родственных производных триптамина». Метаболическая инженерия. 60 : 25–36. DOI : 10.1016 / j.ymben.2019.12.007. ISSN   1096-7176. CS1 maint: несколько имен: список авторов ( ссылка )
  3. ^ Kulkarni R, 2016. Метаболическая инженерия: биологическое искусство производства полезных химических веществ. Резонанс, 21 (3), 233-237.
  4. ^ Вемури, GM, Аристиду, AA, (2005) Метаболическая инженерия в эру -omics: выяснение и модулирование регуляторных сетей, Обзор Microbial Mol Biology, том. 69: 197-216
  5. ^ a b Войт, Эберхард, Торрес, Нестор В. (2002). «Анализ и оптимизация путей в метаболической инженерии». Кембридж: University Press, p.ix-x
  6. Перейти ↑ Stephanopoulos, GN, Aristidou, AA, Nielsen, J. (1998). «Метаболическая инженерия: принципы и методологии». Сан-Диего: Academic Press
  7. ^ Dellomonaco, Клементина. (2011). Спроектированная реверсия цикла бета-окисления для синтеза топлива и химикатов. Природа 476,355-359
  8. ^ Patnaik, Р. и Liao, J. (1994). «Разработка центрального метаболизма Escherichia coli для производства ароматических метаболитов с почти теоретическим выходом». Appl. Environ. Microbiol. 60 (11): 3903-3908
  9. ^ Кислинг Д., Джей (2010). Продвинутое производство биотоплива с помощью микробов. Biotechnol.J., 5,147-162
  10. ^ Мартин, Винсент JJ; Pitera, Douglas J.; Холка, Сиднор Т.; Ньюман, Джек Д.; Кислинг, Джей Д. (01.07.2003). «Разработка мевалонатного пути в Escherichia coli для производства терпеноидов». Природа Биотехнологии. 21 (7): 796–802. DOI : 10.1038 / nbt833. ISSN   1087-0156. PMID   12778056.
  11. ^ Withers, Sydnor T.; Gottlieb, Shayin S.; Лье, Бонни; Ньюман, Джек Д.; Кислинг, Джей Д. (2007-10-01). «Идентификация генов биосинтеза изопентенола из Bacillus subtilis с помощью метода скрининга, основанного на токсичности предшественников изопреноидов». Прикладная и экологическая микробиология. 73 (19): 6277–6283. DOI : 10,1128 / AEM.00861-07. ISSN   0099-2240. PMC   2075014. PMID   17693564.
  12. ^ Стефанопулос, Грегори (2012-11-16). «Синтетическая биология и метаболическая инженерия». Синтетическая биология ACS. 1 (11): 514–525. DOI : 10.1021 / sb300094q. PMID   23656228.
  13. ↑ Калифорнийский университет - Лос-Анджелес (18 декабря 2008 г.). «Генетическая модификация превращает бактерии E. Coli в биотопливо высокой плотности». ScienceDaily. Получено 7 декабря 2011 г. с https://www.sciencedaily.com/releases/2008/12/081218151652.htm.
  14. ^ Schellenberger, J., Que, R., Fleming, R., et al. (2011). «Количественное прогнозирование клеточного метаболизма с помощью моделей на основе ограничений: COBRA Toolbox v2.0». Протоколы природы. 6 (9): 1290-1307
  15. ^ Роча, И., Майя, П., Евангелиста, П. и др. (2010). «OptFlux: программная платформа с открытым исходным кодом для метаболической инженерии in silico». BMC Sys Biol. 45 (4)
  16. ^ Ворк, Т.С., Хинтон, Р., Уорк, Э., Доброта, М., Чард, Т. (1980). «Лабораторные методы в биохимии и молекулярной биологии». v.8
  17. ^ ВИХЕРТ, У. и де Грааф, А. (2000). «Шаги двунаправленной реакции в метаболических сетях: моделирование и моделирование экспериментов по маркировке изотопов углерода». Biotechnol. Bioeng. 55 (1): 101-117
внешняя ссылка

Веб-сайт Организации биотехнологической промышленности (BIO):

Последняя правка сделана 2024-01-02 08:22:54
Содержание доступно по лицензии CC BY-SA 3.0 (если не указано иное).
Обратная связь: support@alphapedia.ru
Соглашение
О проекте