Картирование эпитопов

Карты эпитопов с высоким разрешением антител против Эбола гликопротеина (GP), определены с использованием картирования эпитопов мутагенеза дробовиком. Карты эпитопов предоставляют данные для определения механизма действия (MOA).

Картирование эпитопов - это процесс экспериментальной идентификации сайта связывания или «эпитопа » антитела на его целевом антигене (обычно на белке). Идентификация и характеристика сайтов связывания антител помогают в открытии и разработке новых терапевтических средств, вакцин и диагностических средств. Характеристика эпитопа также может помочь выяснить механизм связывания антитела и может усилить защиту интеллектуальной собственности (патент). Данные экспериментального картирования эпитопов могут быть включены в надежные алгоритмы для облегчения in silico предсказания эпитопов В-клеток на основе данных последовательности и / или структур. Эпитопы обычно делятся на два класса: линейные и конформационные. Линейные эпитопы образованы непрерывной последовательностью аминокислот в белке. Конформационные эпитопы состоят из аминокислот, которые не являются непрерывными в последовательности белка, но собраны вместе при трехмерном сворачивании белка. Исследования картирования В-клеточных эпитопов показывают, что большинство взаимодействий между антигенами и антителами, особенно аутоантителами и защитными антителами (например, в вакцинах), зависит от связывания с конформационными эпитопами.

• 1 Важность для характеристики антител
• 2 Важность для защиты интеллектуальной собственности (IP)
• 3 Методы
• 4 См. Также
• 5 Ссылки
• 6 Внешние ссылки

Предоставляя информацию о механизме действия, картирование эпитопов является критическим компонентом в разработке терапевтических моноклональных антител (mAb). Картирование эпитопа может выявить, как mAb проявляет свои функциональные эффекты - например, блокируя связывание лиганда или улавливая белок в нефункциональном состоянии. Многие терапевтические mAb нацелены на конформационные эпитопы, которые присутствуют только тогда, когда белок находится в своем нативном (правильно свернутом) состоянии, что может затруднить картирование эпитопа. Картирование эпитопов имело решающее значение для разработки вакцин против распространенных или смертельных вирусных патогенов, таких как чикунгунья, денге, Эбола и Вирусы Зика путем определения антигенных элементов (эпитопов), которые обеспечивают длительный эффект иммунизации.

Комплексные антигены-мишени, такие как мембранные белки (например, Рецепторы, связанные с G-белком [GPCR] ) и белки с множеством субъединиц (например, ионные каналы ) являются ключевыми целями при открытии лекарств. Картирование эпитопов на этих мишенях может быть затруднительным из-за трудности экспрессии и очистки этих сложных белков. Мембранные белки часто имеют короткие антигенные области (эпитопы), которые правильно складываются только в контексте липидного бислоя. В результате эпитопы mAb на этих мембранных белках часто являются конформационными и, следовательно, их труднее картировать.

Дробильный мутагенез Картирование эпитопов антител против HER2 обнаружил новый эпитоп (оранжевые сферы). Карты эпитопов предоставляют подтверждающие данные для требований интеллектуальной собственности (патентов).

Картирование эпитопов стало распространенным средством защиты интеллектуальной собственности (IP) терапевтических mAb. Знание специфических сайтов связывания антител усиливает патенты и нормативные документы, проводя различие между существующими антителами и предшествующим уровнем техники (существующими). Способность различать антитела особенно важна при патентовании антител против хорошо подтвержденных терапевтических мишеней (например, PD1 и CD20 ), которые могут быть обработаны множественными конкурирующими антителами. Помимо проверки патентоспособности антител, данные картирования эпитопов использовались для обоснования общих требований к антителам, представленных в Ведомство по патентам и товарным знакам США..

Данные эпитопов играли центральную роль в нескольких громких судебных делах, связанных со спорами по поводу конкретных белковые области, нацеленные на терапевтические антитела. В связи с этим Amgen v. Санофи / Regeneron Pharmaceuticals Ингибитор PCSK9 зависел от способности продемонстрировать, что терапевтические антитела Amgen и Sanofi / Regeneron связываются с перекрывающимися аминокислотами на поверхности PCSK9.

Существует несколько методов картирования эпитопов антител на целевых антигенах:

• рентгеновская сокристаллография и криогенный электронная микроскопия (крио-ЭМ).Рентгеновская совместная кристаллография исторически считалась золотым стандартом для картирования эпитопов, поскольку она позволяет непосредственно визуализировать взаимодействие между антигеном и антителом. Крио-ЭМ может аналогичным образом предоставить карты взаимодействий антитело-антиген с высоким разрешением. Однако оба подхода технически сложны, трудоемки и дороги, и не все белки поддаются кристаллизации. Более того, эти методы не всегда возможны из-за сложности получения достаточного количества правильно свернутого и переработанного белка. Наконец, ни один метод не позволяет различить ключевые остатки эпитопа (энергетические «горячие точки») для mAb, которые связываются с одной и той же группой аминокислот.
• Сканирование олигопептидов на основе массива. Этот метод, также известный как сканирование перекрывающихся пептидов или анализ пептида, использует библиотеку олигопептидных последовательностей из перекрывающихся и неперекрывающихся сегментов целевого белка и проверяет их способность связывать интересующее антитело.. Этот метод является быстрым, относительно недорогим и специально подходит для профилирования эпитопов большого количества антител-кандидатов против определенной мишени. Разрешение картирования эпитопа зависит от количества используемых перекрывающихся пептидов. Главный недостаток этого подхода заключается в том, что его обычно нельзя использовать для получения конформационных эпитопов, которые являются наиболее подходящим типом эпитопа для терапевтических mAb человека. Однако в одном исследовании были картированы прерывистые эпитопы на CD20 с использованием сканирования олигопептидов на основе массива, путем объединения несмежных пептидных последовательностей из разных частей целевого белка и усиления конформационной жесткости этого комбинированного пептида (например, с помощью с использованием каркасов CLIPS).
• сайт-направленный мутагенез картирование. молекулярно-биологический метод сайт-направленный мутагенез (SDM) может быть использован для обеспечения картирования эпитопов. В SDM систематические мутации аминокислот вводятся в последовательность целевого белка. Связывание антитела с каждым мутированным белком проверяют для идентификации аминокислот, составляющих эпитоп. Этот метод можно использовать для картирования как линейных, так и конформационных эпитопов, но он трудоемок и требует много времени, обычно ограничивая анализ небольшим количеством аминокислотных остатков.
• Картирование эпитопов с высокопроизводительным мутагенезом дробовика. Shotgun мутагенез - это высокопроизводительный подход к картированию эпитопов mAb. Метод дробовидного мутагенеза начинается с создания библиотеки мутаций всего целевого антигена, при этом каждый клон содержит уникальную мутацию аминокислоты (обычно замену аланина). Сотни клонов плазмиды из библиотеки индивидуально помещают в 384-луночные микропланшеты, экспрессируют в человеческих клетках и тестируют на связывание антител. Аминокислоты мишени, необходимые для связывания антител, идентифицируются по потере иммунореактивности. Эти остатки картируются в структурах целевого белка для визуализации эпитопа. Преимущества высокопроизводительного картирования эпитопов мутагенеза дробовиком включают: 1) способность идентифицировать как линейные, так и конформационные эпитопы, 2) более короткое время анализа, чем другие методы, 3) представление правильно свернутых и посттрансляционно модифицированных белков и 4) способность идентифицировать ключевые аминокислоты, которые управляют энергетическими взаимодействиями (энергетические «горячие точки» эпитопа).
• Обмен водорода и дейтерия (HDX). Этот метод дает информацию о доступности различных растворителей части антигена и антитела, демонстрируя сниженную доступность растворителя в областях белок-белковых взаимодействий. Одним из его преимуществ является то, что он определяет сайт взаимодействия комплекса антиген-антитело в его нативном растворе и не вносит никаких модификаций (например, мутаций) ни в антиген, ни в антитело. Картирование эпитопа HDX также было продемонстрировано как эффективный метод для быстрого предоставления полной информации о структуре эпитопа. Обычно он не предоставляет данные на уровне аминокислот, но это ограничение улучшается за счет новых технологических достижений. Недавно он был рекомендован в качестве быстрого и экономичного подхода к картированию эпитопов на примере комплексной белковой системы гемагглютинина вируса гриппа.
• Масс-спектрометрия с перекрестным связыванием. Антитело и антиген связаны с меченым перекрестным -линкер, и образование комплекса подтверждается детектированием с высокой массой MALDI. Место связывания антитела с антигеном затем можно определить с помощью масс-спектрометрии (MS). Сшитый комплекс очень стабилен и может подвергаться воздействию различных ферментативных условий и условий переваривания, что позволяет обнаруживать множество различных вариантов пептидов. Методы MS или MS / MS используются для определения аминокислотных положений меченых сшивающих агентов и связанных пептидов (определяются как эпитоп, так и паратоп в одном эксперименте). Ключевым преимуществом этого метода является высокая чувствительность обнаружения МС, что означает, что требуется очень мало материала (сотни микрограммов или меньше).

Другие методы, такие как дрожжевой дисплей, фаговый дисплей и ограниченный протеолиз обеспечивают высокопроизводительный мониторинг связывания антител, но не имеют разрешения, особенно для конформационных эпитопов.

• Биологический портал

• Эпитоп binning

• Epitope + mapping в Национальной медицинской библиотеке США Медицинские предметные заголовки (MeSH)